雌二醇通過上調M-CSF表達促進乳腺癌教化單核細胞

季秋蘭　丁景弦

【摘要】 目的：研究雌二醇對MCF-7細胞教化單核細胞分化為腫瘤相關巨噬細胞的影響。方法：分別用10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬處理雌激素受體陽性乳腺癌細胞株MCF-7，48 h后收集細胞培養上清，利用細胞因子芯片檢測不同處理組單核細胞活化相關蛋白與空白對照組MCP-1及M-CSF的表達差異，利用細胞Transwell niche檢測其對單核細胞活化功能的影響。結果：Bio-Rad細胞因子芯片檢測發現空白對照組、雌二醇組及雌二醇+他莫昔芬組細胞上清中CSF1濃度分別為（1.83±0.18），（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，MCP-1分別為（31.33±2.40），（75.37±5.50）和（41.97±5.80）pg/mL，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。雌二醇處理組CD163的mRNA水平是對照組（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇組是對照組的（6.5±1.71）倍，比較差異有統計學意義（F=96，P<0.01）。對照組、雌二醇處理組及他莫昔芬加雌二醇處理組每個高倍鏡視野內U937細胞數目分別為（28±6）、（188±16）及（82±9）個，比較差異有統計學意義（F=160，P<0.05）。結論：雌二醇通過上調激素依賴型乳腺癌細胞株MCF-7表達M-CSF從而增強其對單核細胞的教化，而他莫昔芬可部分阻斷其發揮效應。

【關鍵詞】 激素依賴型乳腺癌; 雌二醇; 他莫昔芬; MCP-1; M-CSF

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Estradiol on educating monocyte differentiation into tumor associated macrophage in MCF-7 coculture system.Method：48 h after treated with 10 nM Estradiol or10 nM Estradiol+1 μM Tamoxifen，MCP-1 and M-CSF in human breast cancer cell line MCF-7 culture supernatant were detected，they were given Transwell niche to further explore their effects on the recruitment and activation of monocyte.Result：Bio-Rad cytokine chip assay showed that the M-CSF concentration in the supernatant of blank control group，Estradiol group and Estradiol+Tamoxifen group were （1.83±0.18），（29.71±8.06） and （10.90±2.38） pg/mL，and the MCP-1 concentration were （31.33±2.40），（75.37±5.50） and （41.97±5.80） pg/mL respectively，the differences were statistically significant（P<0.05）.The level of CD163 mRNA in estradiol treatment group was （76.83±12.80） times higher than that in control group，and that in Estradiol+Tamoxifen group was （6.50±1.71） times higher than that in control group （F=96，P<0.01）.The number of U937 cells in the control group，the Estradiol treatment group and the Estradiol+Tamoxifen treatment group were （28±6），（188±16） and （82±9） respectively，the difference was statistically significant （F=160，P<0.05）.Conclusion：Estradiol may promote hormone dependent breast cancer cell lines MCF-7 to secrete MCP-1 and M-CSF，thereby educate monocyte differentiation into tumor associated macrophage，while Tamoxifen may partially block the effect.

【Key words】 Hormone dependent breast cancer; Estradiol; Tamoxifen; MCP-1; M-CSF

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.007

乳腺癌是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤，美國癌癥統計數據顯示女性一生中患上乳腺癌的概率約1/8[1]。盡管與其他實體瘤相比乳腺癌患者預后較好，然而不同類型乳腺癌之間預后差異較大。根據乳腺癌細胞雌激素和/或孕激素受體表達情況可分為激素依賴型乳腺癌和激素非依賴型乳腺癌，其生存復發模式相差很大。Saphner等[2]研究發現激素受體陽性乳腺癌總體年復發風險較激素受體陰性者低，且復發時限呈現雙峰分布，即在術后3年及術后7年各有一復發高峰，而激素受體陰性患者復發高峰主要是在手術后2年。病理學之父Stephen Paget醫生于1889年首次提出了腫瘤起源的“種子與土壤”理論，該學說認為微環境可以影響腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[3]。近年來，越來越多的學者將關注點轉移到腫瘤細胞賴以生存的微環境上。腫瘤微環境即腫瘤中的非腫瘤細胞成分，主要包括細胞外基質和各種基質細胞，它們為癌細胞發生發展提供養分和支撐。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是微環境中的主要細胞成分之一，在腫瘤發生發展中起到重要作用。文獻[4-7]報道TAMs豐度是乳腺癌獨立的預后因素并有望成為乳腺癌治療的新靶點。

TAMs是由血液中的單核細胞游出進入組織后在MCP-1、M-CSF、IL-6及IL-10等相關細胞因子的作用下分化而成，通常具有M2表型。TAMs在組織修復、基質重塑和血管生成等方面起到重要促進作用，并促進腫瘤的發生發展。乳腺癌細胞可通過分泌MCP-1及M-CSF進而招募單核細胞并教化其分化為M2型TAMs，TAMs增加血管內皮生長因子的合成，從而為腫瘤細胞生長提供養分促進腫瘤生長。研究表明激素非依賴型乳腺癌細胞通常高表達MCP-1及M-CSF，而且MCP-1及M-CSF的表達水平與乳腺癌的高侵襲和高轉移成正相關[8]。筆者前期研究發現MCF-7細胞在體外常規培養時具有高增殖能力，免疫細胞化學顯示其Ki67陽性比例高，然而在移植瘤模型中不添加雌激素時MCF-7細胞株卻不能在SCID小鼠形成移植瘤。本研究擬在前期研究的基礎上闡述雌激素對MCF-7乳腺癌細胞教化單核細胞活化分化的影響，結合臨床為他莫昔芬內分泌治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人乳腺癌細胞株MCF-7細胞原購自美國ATCC細胞庫，U937細胞株由復旦大學馬端教授饋贈。GFP-PURO雙標穩定表達U937細胞系及RFP-NEO雙標穩定表達MCF-7細胞系由本人攻讀博士學位期間建立[9]。

1.2 藥物和試劑 RPMI 1640細胞培養液（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），雌二醇及他莫昔芬（Sigma公司），RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaLa公司，細胞因子檢測試劑盒由Bio-Plex公司專門制備。

1.3 儀器 CO2培養箱購自Thermo公司，Transwell板購自康寧公司，實時熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 將含5×103個MCF-7細胞的完全培養基200 μL接種于96孔板中，細胞貼壁生長后吸出培養上清，向其中分別加入100 μL無血清培養基、10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬無血清培養基繼續培養48 h后收集上清，200 g離心5 min除去細胞碎片，相關實驗操作參考查錫良及沈祥春等發表文獻[10-11]，收集上清放置于-80 ℃冰箱保存待做細胞因子檢測。

1.4.2 細胞因子芯片檢測MCP-1及M-CSF濃度本實驗預訂的Bio-plex細胞因子芯片是利用磁珠吸附原理檢測不同培養上清中單核細胞分化相關細胞因子MCP-1及M-CSF濃度，實驗操作按照產品說明書操作流程進行。

1.4.3 MCF-7乳腺癌細胞與U937細胞共培養 將不同實驗組中5×105個MCF-7細胞接種于Transwell板（6孔，孔徑0.4 μm）上室中，下室種5×105個U937細胞，共培養48 h后觀察空白對照組、10 nM雌二醇處理組及10 nM+1 μM他莫昔芬處理組乳腺癌MCF-7細胞對U937細胞教化分化為M2型TAMs的差異。

1.4.4 逆轉錄實時定量PCR驗證雌激素對MCF-7乳腺癌細胞教化單核細胞分化 U937細胞與不同處理組MCF-7細胞共培養48 h后，利用總RNA提取試劑盒Trizol按實驗流程提取總RNA，利用TaKaLa試劑盒反轉錄得到cDNA。利用real-time PCR檢測不同處理組U937細胞CD163表達差異。GAPDH作為內參基因，擴增片段引物系列見表1，PCR反應條件參考既往發表文獻[12]。

1.5 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雌二醇對MCF-7細胞MCP-1及M-CSF表達的影響 空白對照組、雌二醇處理組及雌二醇+他莫昔芬處理組乳腺癌細胞株MCF-7培養上清中單核細胞分化相關細胞因子MCP-1及M-CSF蛋白濃度分別為（31.33±2.40）、（75.37±5.50）及（41.97±5.80）pg/mL，（1.83±0.18）、（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，不同處理組間MCP-1及M-CSF濃度差異均有統計學意義（F=68，P<0.01）。雌二醇可促進MCF-7細胞分泌MCP-1及M-CSF，而他莫昔芬可部分阻斷該效應。見圖1。

2.2 雌二醇處理MCF-7細胞對共培養體系中U937細胞教化影響 MCF-7細胞與U937細胞共培養48 h后U937細胞形態發生改變，由光滑小圓形懸浮細胞部分轉變成為不規則形細胞，并有部分細胞呈現貼壁生長特性，見圖2。空白對照組、雌二醇處理組及雌二醇+他莫昔芬處理組MCF-7細胞與U937細胞共培養，雌二醇處理組與U937細胞共培養48 h后CD163的mRNA水平經RT-qPCR檢測M2型巨噬細胞較對照組明顯提高，而他莫昔芬可以部分阻斷其效應，雌二醇處理組CD163的mRNA水平是對照組（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇組是對照組的（6.50±1.71）倍，比較差異有統計學意義（F=96，P<0.01）。見圖3。對照組、雌二醇處理組及他莫昔芬加雌二醇處理組每個高倍鏡視野內U937細胞數目分別為（28±6）、（188±16）及（82±9）個，比較差異有統計學意義（F=160，P<0.05），表明雌二醇能增強MCF-7細胞對U937細胞的教化作用，而他莫昔芬可部分阻斷這種效應，見圖4。

3 討論

雌二醇在激素依賴型乳腺癌的發生和發展過程中發揮重要作用，是癌細胞賴以生存的有利“土壤”[13]。研究表明，雌二醇主要通過與雌激素受體結合來發揮促腫瘤效應，然而具體下游信號通路機制尚不明確。他莫昔芬作為一種雌激素受體調節劑，是一種臨床上常見的激素依賴型乳腺癌患者內分泌治療藥物。他莫昔芬通過與雌二醇競爭性結合雌激素受體，從而阻斷雌二醇對激素依賴型乳腺癌細胞的促進作用，可有效降低激素依賴型乳腺癌患者的復發死亡風險[14-15]。TAMs是腫瘤微環境中的重要細胞組成成分，主要通過促進新血管生成和瘤旁炎性反應等來發揮其在腫瘤生長、轉移的作用。