非小細胞肺癌患者病理組織中MTH1的表達及臨床意義研究*

杜鳳華，閔旭紅，孔維博，孔祥舟，梅曉冬

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院呼吸內科，合肥 233001；2.安徽省胸科醫院放射介入科，合肥 233003)

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，發病率高且嚴重危及人類的健康[1]。隨著現代分子腫瘤學的進步，各種分子靶向治療取得了較大進步，但肺癌的預后仍然很差[2]，亟須尋找新的肺癌預后分子標志物和治療靶點。有學者認為癌癥的發生是細胞在各種內外環境刺激下導致原癌基因和抑癌基因平衡失調、細胞增殖失控的過程[3]。氧化應激、缺氧和表觀遺傳障礙在癌癥的發生、發展中起到重要的作用。呼吸、正常代謝和炎性反應過程均產生活性氧(ROS)[4]，ROS可氧化核苷酸和蛋白質，誘導基因突變和導致細胞衰老[5]。ROS可氧化核苷酸庫中的dGTP或直接氧化DNA中的鳥嘌呤堿基而產生8-氧代-鳥嘌呤(8-氧-G)。在DNA復制過程中，DNA聚合酶通常在模板DNA中插入8-氧代-dGTP，從而導致A到C或G到T的顛換突變[6]。

MutT同系物1(MutT homolog 1，MTH1)是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶，將8-氧代-dGTP水解成其單磷酸形式，從而阻止DNA聚合酶將8-氧代-dGTP插入基因組[8]，對細胞基因組的穩態起到保護作用。暴露于煙草煙霧或電離輻射，會增加正常細胞中的ROS水平[7]，這可能導致核苷酸庫中的8-氧-G積累。DNA中8-氧-G的過度積累可誘導細胞凋亡，因此癌細胞可能獲得防止DNA中8-氧-G積累機制。事實上，MTH1在腦癌、乳腺癌和胃癌中表現豐富[8-9]。動物實驗提示：MTH1是癌細胞增殖必需的酶，靶向MTH1可抑制由腫瘤細胞系發展而來的腫瘤的增殖[10-11]。這些發現提示MTH1在癌癥發展中起重要作用。盡管如此，MTH1在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達情況和臨床意義尚不清楚。本研究通過免疫組織化學方法檢測197例NSCLC患者中MTH1蛋白的表達，探討MTH1表達與患者臨床病理因素和生存期之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年3月至2013年3月安徽醫科大學附屬省立醫院收治的可手術切除的NSCLC患者205例，均接受外科手術治療。納入標準：(1)年齡大于18歲，病理診斷為NSCLC；(2)術前未接受放化療。排除標準：(1)患者缺乏足夠的腫瘤組織；(2)術后診斷為小細胞肺癌；(3)術后的隨訪資料不完整。最終納入研究197例，對全部病理標準重新評估，TNM分類第8版用于病理分期[12]。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 從患者的病歷資料中提取年齡、性別、吸煙史、BMI、輔助治療、病理診斷、間質性肺炎和表皮生長因子受體(EGFR)突變等臨床病理信息。

1.2.2隨訪 患者手術后即開始隨訪，術后的前3年每隔6個月行1次胸部CT和血液腫瘤標志物檢查，以后每年進行1次胸部CT檢查，對懷疑復發的患者，采用PET檢查或病理活檢確診。

1.2.3病理組織MTH1的免疫組織化學 病理組織切片脫蠟后，用過氧化物酶封閉劑(080-01186 Wako，日本)和蛋白封閉劑(19-2410-3 Sigma-Aldrich，美國)處理標本。將組織切片與抗MTH1抗體(1∶100的稀釋度，兔抗人MTH1抗體，Sigma-Aldrich，美國)溫育。然后與DAKO ENVISION+聚合物/辣根過氧化物酶(HRP，抗兔;K4003 Dako，Tokyo，日本)溫育。液體DAB+發色團(049-22831，Wako，Osaka，日本)用于顯現抗原。用蘇木素對組織標本進行復染以區分細胞核和細胞質。

1.2.4MTH1免疫組織化學評分和患者分組 兩位獨立的病理學家評估免疫組織化學的結果，根據MTH1染色細胞占總癌細胞比例確定評分[18]：1分，0～<20%；2分，20%～<40%；3分，40%～<60%；4分，60%～<80%；5分，80%～100%。同時，本研究根據MTH1染色評分進行受試者工作曲線分析其預測患者總生存率和無瘤生存率，ROC曲線提示最佳截斷值為3.234和3.443，將MTH1表達截止值設定為3分。<60%的腫瘤細胞染色評定為MTH1高表達組；≥60%的腫瘤細胞染色評定為MTH1低表達組。

2 結 果

2.1全部患者的臨床特征和MTH1表達情況 全組患者197例，其中男120例(60.9%)，女77例(39.1%)，中位年齡54(38，83)歲。104例(52.8%)患者吸煙史大于20包/年。腺癌140例(71.1%)，鱗癌42例(21.3%)，其他類型15例(7.6%)。在74例腫瘤中評估EGFR突變狀態，24例(32.4%)患者存在EGFR突變，見表1。MTH1主要在肺癌細胞的細胞核中表達，細胞質中無表達，正常的肺組織細胞存在少許表達，見圖1。其中MTH1高表達組111例(56.3%)，低表達組86例(43.7%)。

2.2MTH1表達與臨床病理參數之間的關系 MTH1高表達和男性、吸煙大于20包/年、鱗癌、病理分期大于Ⅰ期、腫瘤直徑大于3 cm、淋巴結轉移、胸膜浸潤陽性、淋巴管浸潤和血管浸潤顯著性相關(P<0.05)。在評估EGFR突變狀態的74例患者中，野生型EGFR傾向于與MTH1高表達相關(P<0.05),見表1。

A:MTH1高表達組；B:MTH1低表達組

圖1NSCLC癌組織免疫組織化學染色(100×)

表1 MTH1高表達和低表達組與臨床病理參數之間的關系[n(%)]

a：n=74

2.3MTH1高、低表達組總生存率及無瘤生存率之間關系 Kaplan-Meier曲線的生存分析顯示，MTH1高表達組預后顯著性低于MTH1低表達組。MTH1高表達組和MTH1低表達組5年總生存率分別為81.6%和92.3%(P=0.001 1)，5年無瘤生存率分別為55.0%和83.7%(P=0.000 2)，見圖2。

圖2 MTH1高低表達患者的總生存率和無瘤生存率的比較

圖3 肺腺癌MTH1高、低表達組的總生存率和無瘤生存率比較

2.4肺腺癌和肺鱗癌MTH1表達與總生存率及無瘤生存率的關系 肺腺癌患者MTH1高、低表達組5年總生存率分別為76.5%和95.4%(P=0.003 1)，無瘤生存率分別為55.3%和85.3%(P=0.000 7)。MTH1表達對肺鱗癌患者的總生存率及無瘤生存率無顯著影響,見圖3、4。

圖4 肺鱗癌MTH1高、低表達組的總生存率和無瘤生存率比較

2.5患者總存率的單因素和多因素分析 單因素分析顯示：MTH1與病理分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤一起構成總生存率的顯著性危險因素；而多因素分析提示：MTH1表達(HR=1.713,95%CI:1.865～4.118,P=0.047 0)和淋巴結轉移(HR=9.190,95%CI:2.824～39.457,P<0.01)是患者總生存率的獨立危險因素，見表2。

2.6患者無瘤生存率的單因素和多因素分析 單因素分析顯示：MTH1與性別、吸煙程度、病理分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤一起構成總生存率的顯著性危險因素；而多因素分析提示：MTH1表達(HR=1.605，95%CI：1.627～3.248,P=0.039 0)和淋巴結轉移(HR=4.502，95%CI：1.942～11.546,P=0.000 3)是患者無瘤生存率的獨立危險因素，見表3。

表2 總體生存率的單因素和多因素分析(n=197)

續表2 總體生存率的單因素和多因素分析(n=197)

表3 無瘤生存率的單因素和多因素分析(n=197)

續表3 無瘤生存率的單因素和多因素分析(n=197)

3 討 論

肺癌是病死率最高的癌癥，對人類的健康和生命具有極大的威脅。在現代腫瘤分子生物學研究的證實下，發生癌癥的原因是多種因素共同作用、多種基因共同參與、多階段的經歷最終發展而成的十分復雜的生物學的行為。究其根本，肺癌的發生和癌癥基因被激活及抑制癌癥的基因失去活性有重要的聯系，以上兩種因素會直接造成腫瘤細胞失去凋亡功能，進而通過多種調控機制和血管生成因子的互相作用，進一步促使癌癥的發生。而血管內皮細胞生長因子是目前所知的作用最強的促血管生長因子，能夠增強血管通透性，刺激血管內皮細胞的產生，對內皮細胞具有特意分裂能力。

NSCLC發病的機制為癌基因和抑癌基因失衡導致的細胞增殖失控，DNA精準復制過程是基因表達的基礎。內外各種原因所致的DNA或DNA組成成分的損傷均可導致基因表達失控或細胞凋亡。

MTH1是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶，將8-氧代-dGTP水解成其單磷酸形式，通過清除核苷酸庫中的氧化核苷酸來維持體細胞中遺傳信息完整性，防止細胞在復制過程中將8-氧-G摻入DNA和8-氧-G在細胞核中過度累積而導致細胞壞死。癌細胞常暴露于比周圍正常細胞更高的氧化應激水平，并且MTH1在癌細胞中高表達，通過阻止氧化的dNTPs摻入DNA[10]，表明MTH1有助于癌細胞增殖[8]。MTH1活性對癌細胞完整性是必需的[10]。在NSCLC中，MTH1 mRNA過度表達，并與細胞8-氧-G水平呈負相關。有研究報道NSCLC組織中MTH1活性高于正常肺組織。然而，NSCLC中MTH1蛋白升高的臨床意義尚不清楚。

本研究發現MTH1蛋白高表達與NSCLC患者的腫瘤惡性潛能(淋巴結轉移和腫瘤分期晚期)有關。這些發現與先前評估腎細胞癌中MTH1 mRNA表達的臨床報道一致。本研究還發現MTH1高表達患者的無瘤生存率和總生存率均低于MTH1低表達的患者。此為首次發現MTH1高表達和NSCLC生存期相關。多因素分析顯示MTH1高表達是患者無瘤生存率和總生存率的獨立的預后因子。這個研究結果提示腫瘤細胞增殖可能與需要MTH1的表達來對抗ROS所致的細胞DNA損傷有關。

MTH1如何影響NSCLC的生物學行為的精確機制尚不清楚。綜合文獻報道和本研究結果發現，MTH1表達增加NSCLC患者癌細胞的惡性潛能。在NSCLC的癌細胞中，具有高侵襲性的腫瘤細胞可能較多地暴露在ROS刺激下，誘導MTH1高表達，修復DNA，行快速增殖，使得腫瘤細胞更具有向淋巴管、血管浸潤和胸膜浸潤的潛能。癌細胞代謝研究提示：高侵襲性和進行性增殖癌細胞依賴于有氧糖酵解，實現DNA快速復制,分裂成子細胞并傳播到身體其他部位。這表明癌細胞中產生更多的氧化應激[7]和ROS，導致更多的8-氧-G累積，導致癌細胞的壞死。事實上，癌細胞可能通過MTH1表達的增加逃避ROS所致的DNA損傷，從而表現出更高的惡性潛能。從而導致患者的預后更差。本研究顯示MTH1高表達與重度吸煙(>20包/年)顯著性相關，吸煙則是氧化應激的觸發因素，吸煙量顯著性增加肺組織中ROS的水平。結合本研究的發現，提示吸煙患者肺癌的癌細胞惡性潛能更高，能應對過度的氧化應激。高氧化應激環境中的癌細胞可能通過提高MTH1的表達而防止DNA中8-氧-G的累積。因此，MTH1可能是癌細胞氧化應激的標志物，也是肺癌患者生存期較差的指標。

在肺癌的治療中，手術、放療和化療被認為是標準治療，但是對部分患者預后仍不理想，需要新的治療策略來延長NSCLC患者的預后。有研究顯示，阻斷MTH1有助于抑制細胞增殖[11,24]和上皮-間質轉化[15]，從而支持MTH1可作為NSCLC患者治療靶點。在本研究中，41%患者MTH1高表達，提示一些NSCLC患者可能會在未來的抑制MTH1的靶向治療中收益，其作為治療靶點的潛力尚需要進一步研究。

本研究有幾個局限性：(1)這是在單一機構中進行的回顧性研究，尚需要多中心、大樣本量的研究驗證。(2)免疫組織化學結果的評估標準問題，盡管本研究通過ROC曲線尋找最佳的免疫組織化學評分的截斷值，尚需要建立統一的標準來評估MTH1的表達狀態來區分臨床上亞組。(3)腫瘤細胞中MTH1高表達的精確機制尚需進一步研究。

綜上所述，在NSCLC中，MTH1高表達患者表現出更高的惡性特征。MTH1高表達患者的無瘤生存率和總生存率低于MTH1低表達患者，同時MTH1表達是NSCLC預后的獨立危險因素。NSCLC患者術后病理MTH1表達狀態有助于區分預后較差的患者，其也可能成為NSCLC新的潛在治療靶點。