半胱亞磺酸脫羧酶在妊娠小鼠子宮和胚胎中的表達定位研究*

李 煒，呂釗旭，馮永珍，張淑芝，左語馨，范晶晶,5△

(1.濰坊護理職業學院內科教研室，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市婦幼保健院新生兒科 261000；3.濰坊學院校醫院護理部，山東濰坊 261061；4.濰坊學院生物與農業工程學院，山東濰坊 261061；5.山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室/濰坊學院，山東濰坊 261061)

哺乳動物妊娠是一個非常復雜的過程，成功的妊娠需要多種分子的協同作用，如類固醇激素、特定生長因子、細胞因子、脂類介質、黏附分子和轉錄因子等[1]。近年來在胚胎自身和子宮內膜中發現的蛋白質、小分子肽類和一些氨基酸在妊娠過程中起十分重要的作用，其中牛磺酸發揮的作用逐漸引起人們的重視[2-3]。在哺乳動物生殖系統中?；撬崾呛孔钬S富的游離氨基酸之一，并且在卵母細胞和著床前的胚胎中都有很高的含量[4-5]。體外培養條件下牛磺酸可以提高兔、小鼠和豬等動物胚胎的桑葚胚率和囊胚率[6-8]。如果在妊娠和哺乳過程中缺乏?；撬?，后代就會出現生長發育停滯、畸形發育、視網膜退化、心肌損害和中樞神經系統的機能紊亂等現象[9-10]。這些研究提示?；撬釋τ谌焉镞^程子宮生理作用的正常發揮及胚胎的發育可能起到非常重要的作用。

牛磺酸的多種生物學效應的發揮依賴于它在細胞內的濃度，細胞內?；撬醽碓粗饕袃煞N：一種可以通過牛磺酸轉運體(TauT)從胞外轉運，另一種可以通過細胞內含有的半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)自身合成[11]。CSD是一種同源二聚體酶，屬于Ⅱ型脫羧酶家族，其底物為半胱亞磺酸，產物為二氧化碳和亞?；撬?，現在一般認為CSD是哺乳動物生物合成?；撬岬闹饕匏倜竅12]。本實驗采用免疫組織化學和原位雜交的方法，直觀地研究CSD在妊娠早期小鼠子宮和胚胎的表達及定位情況，為研究CSD和牛磺酸在妊娠子宮發揮的生理功能及對胚胎發育的作用等奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 采用8周齡昆明小鼠，控制溫度為25 ℃，自然光周期條件下飼養。取發情期雌鼠與雄鼠自然交配，采集妊娠第1～9天著床點與非著床點的子宮組織，4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學。第7天子宮著床點組織、第11天胚胎在10倍體積的4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，再放入30%蔗糖溶液中浸泡直至組織沉降，取第7天著床點組織用Tissue Tek OCT包埋用于原位雜交，第11天小鼠胚胎進行全胚原位雜交。

CSD多抗由法國TAPPAZ教授(INSERM U 433)贈送，堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG(GAR-AP)、堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(anti-DIG-AP)購自北京中杉金橋公司。Trizol、M-MLV購自美國Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、質粒小提和大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。地高辛標記試劑盒(DIG Oligonucleotide 3′-End Labeling Kit)購自瑞士Roche公司。pMD18-T DNA質粒購自日本TaKaRa公司。乙酰化溶液：10 mL 1 mol/L TEA(pH 8.0)、90 mL焦碳酸二乙酯(DEPC)水、250 μL醋酸酐混勻。Solution B1溶液：100 mL 1 mol/L Tris pH 7.5和30 mL 5 mol/L NaCl用蒸餾水定容至1 L，滅菌室溫保存。NBT/BCIP顯色液：3.4 μL 100 mg/mL NBT，3.5 μL 50 mg/mL BCIP，2.4 μL 24 mg/mL 左旋咪唑，5.0 μL 10% Tween-20，986.0 μL NBT/BCIP顯色液。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色 將石蠟包埋好的子宮組織切成5 μm厚連續切片，找到著床點及胚胎進行免疫組織化學。脫蠟，過梯度乙醇水化，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，放置至室溫，羊血清封閉，按1∶1 000稀釋CSD抗體(一抗)滴加在組織上，放入濕盒4 ℃冰箱過夜。第2天洗掉一抗，加入GAR-AP(1∶200)，孵育2 h，NBT/BCIP顯色液顯色，封片，顯微鏡照相。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其他步驟完全相同。

1.2.2原位雜交

1.2.2.1探針制備 針對CSD基因(GeneBank序列號：144942.4)設計實時熒光定量PCR(RT-PCR)引物，正向引物序列為：5′-AGC ACC TCC TCT TCC ATG AG-3′，反向引物序列為：5′-GAT GGC TGA CTC AAA ACC AC-3′。RT-PCR擴增目的基因，純化回收擴增產物，將產物連接到pMD18-T DNA質粒，質粒轉化步驟參考文獻[13]方法，重組質粒的酶切及PCR鑒定參考文獻[14]方法。酶切、鑒定純化的質粒DNA分別用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段。線性化后的質粒用DNA凝膠回收試劑盒回收，用紫外分光光度計測定線性化DNA濃度。純化后的探針使用地高辛標記試劑盒進行標記。

1.2.2.2雜交方法 將包埋好的第7天子宮著床點組織切成10 μm厚的冰凍切片，室溫風干30 min，4%四氟乙烯-全氟烷氧基乙烯基醚共聚物(PFA)固定10 min，PBS清洗5 min，乙酰化溶液處理10 min，DEPC水清洗5 min，5 μg/mL蛋白酶K溶液處理5 min，PBS清洗5 min。預雜交液孵育4～8 h，然后用CSD探針雜交液(5 μg/mL)50 ℃孵育過夜。第2天清洗雜交液，牛血清封閉1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日取出切片用Solution B1室溫清洗10 min，NBT/BCIP顯色液顯色，顯色結束終止反應，70%甘油封片并照相。

第11天胚胎從4%多聚甲醛固定，取出，依次通過含100%、95%、75%、50%甲醇PBS溶液，然后放置于PBS中，用10 μg/mL蛋白酶K消化處理20 min，清洗后放入含有0.1%戊二醛的4%多聚甲醛溶液再固定20 min，PBS清洗后，放入65 ℃含有1 μg/mL探針的雜交液中過夜。次日清洗雜交液，用20%胎牛血清封閉1 h，加anti-DIG-AP(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日取出放入含1% 牛血清清蛋白(BSA)的PBS-Tween-20(PBST)中清洗，每2小時換液1次，PBST浸泡過夜。次日取出放入PBST中清洗2次，每次30 min，BM purple顯色液顯色，TE清洗終止顯色，解剖鏡下照相。正義鏈探針為陰性對照，原位雜交操作與反義鏈探針相同。

2 結 果

2.1免疫組織化學染色結果 免疫組織化學染色結果見圖1，藍色為CSD陽性信號，分布在細胞質中。在妊娠第1、2天子宮中CSD主要定位在子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞，而第3、4天大量子宮基質細胞也表現出較強的CSD陽性。第6天開始胚胎周圍的子宮蛻膜細胞不表達CSD，但貼近子宮系膜緣和系膜對側緣均高表達CSD。第8天開始子宮CSD的表達明顯減弱，第9天表達更弱，只有系膜對側緣子宮CSD呈中等程度陽性反應。在第9天著床點間的子宮CSD主要定位在腔上皮和腺上皮細胞。第4天子宮中的囊胚內細胞團和滋養層細胞都表達CSD，到第9天胚胎都有CSD陽性。陰性對照未檢測到陽性信號，見圖1。

le:腔上皮;ge：腺上皮；S：基質；myo：子宮肌層；bl:囊胚；em：胚胎；M：系膜緣；Am：系膜對側緣；IS：著床點；Inter-IS：著床點之間的子宮(標尺為20 μm)

圖1CSD在妊娠小鼠子宮中的免疫組織化學分布

em：胚胎；M：子宮系膜緣；Am：子宮系膜對側緣；IS：著床點；Inter-IS：著床點間的子宮(標尺為100 μm)

圖2原位雜交檢測CSD的第7天胚胎和子宮定位

2.2原位雜交結果 第7天胚胎和著床點子宮中都能檢測到CSD mRNA陽性信號，子宮系膜對側緣CSD陽性表達明顯，胚胎周圍的子宮蛻膜細胞未檢測到陽性信號。第7天CSD主要定位于腔上皮和腺上皮細胞，陰性對照未檢測到陽性信號。第11天CSD定位于腦、心臟、脊髓，見圖2、3。

Hb：后腦；T：端腦

圖3原位雜交檢測CSD的第11天胚胎定位

3 討 論

雌激素(E2)和孕激素(P4)是胚胎著床過程中最重要的兩種激素，E2主要刺激子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞增殖，P4主要刺激子宮內膜基質細胞增殖，并誘導基質細胞分化為蛻膜細胞[15]。本研究結果顯示CSD在第1～9天子宮的表達有一定的動態變化，第1～2天主要定位在子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞，第3天開始子宮基質細胞也出現陽性表達。LOBO等[16]用免疫組織化學檢測到?；撬嵩诎l情后期、間情期大鼠子宮的腔上皮細胞和腺上皮細胞表達。子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞具有分泌功能，其分泌物是子宮液的主要來源，本實驗結果說明子宮腔上皮細胞和腺上皮細胞可以通過CSD途徑自身合成?；撬岱置诘阶訉m液中發揮生理作用，并且可能與E2和P4對子宮細胞的增殖調控有關。妊娠第4～5天被稱為小鼠胚胎著床窗口期是妊娠最重要的一個時期，此時的胚胎要受到多種因子的復雜調控才能成功著床[1]。本實驗的結果顯示從第3天開始大量子宮基質細胞開始表達CSD，CSD表達急劇增加說明可能在著床窗口期子宮需要合成大量?；撬幔灿锌赡芘；撬嶙鳛橐环N信號分子作用于子宮為接受胚胎做準備。從第6天開始胚胎周圍的子宮蛻膜細胞中檢測不到CSD，第8天子宮CSD的反應明顯減弱，第9天表達更弱，只有子宮系膜對側緣有微弱表達，胚胎從囊胚到第9天胚胎都有CSD陽性。著床過程結束后子宮CSD表達開始下降，可能是由于?；撬嵝枨罅繙p少或胚胎通過自身CSD合成的?；撬嵋呀浤軡M足發育的需要。CSD的表達模式說明?；撬嵩谥步⒁院?，可能對胚胎正常發育起一定作用。

原位雜交顯示CSD第7天定位于著床點子宮和胚胎中，胚胎周圍的子宮蛻膜細胞無表達。第11天定位于胚胎腦、心臟、脊髓。KIM等[17]采用RT-PCR方法也檢測到CSD mRNA在ICR小鼠胚胎發育第4、10、15、18天都有表達。STURMAN等[18]發現缺乏?；撬岬拇曝埳碌淖阍滦∝埫黠@比正常貓小，腦質量明顯降低，腦形態異常。補充牛磺酸可改善生長受限的胎鼠神經干細胞的增殖[19]?；蚯贸；撬徂D運蛋白引起的?；撬岷慕邥е滦募∥s和心肌病[20]。以上結果說明在胎兒的心血管系統、神經系統等重要系統里是可以通過CSD途徑合成?；撬?，牛磺酸對胚胎重要系統的生長發育發揮一定作用。

綜上所述，CSD在妊娠小鼠子宮和胚胎中的表達動態變化，?；撬峥赡茉谂咛グl育和著床、調節妊娠子宮狀態中發揮一定的作用。牛磺酸在胚胎發育過程中的作用及機制仍需進一步研究。