阿薩希毛孢子菌體外亞硫酸氫鈉甲萘醌抗氧化誘導及對其形態學影響的研究

李海濤，歐敏儀，敖俊紅，楊蓉婭，祝 賀

近30年來，由于廣譜抗生素、糖皮質激素、抗腫瘤藥的廣泛使用，以及器官移植、放化療、導管插管等技術的普遍應用，真菌感染大幅增加，深部真菌感染已成為住院患者死亡的主要原因之一[1,2]。阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是毛孢子菌屬中最重要的臨床致病菌，可引起皮膚感染、夏季超敏性肺炎和深部感染，特別是播散性深部感染，病死率達80%以上[3-6]，且該菌對臨床常見的抗真菌藥物如卡泊芬凈、兩性霉素B、氟康唑等均耐藥[7-9]。目前為止，該菌的感染致病機制尚不明確，因此需要探索T.asahii的感染和致病機制、研發新的抗真菌藥物。

病原體的抗氧化機制與其致病性密切相關，這一點不僅在細菌[10]，在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見致病真菌的研究中已經得到證實[11-13]。在本課題組前期研究發現H2O2（hydrogen peroxide）、二酰胺、甲萘醌可對T.asahii可產生不同程度的氧化殺傷作用，其中甲萘醌的殺傷作用最強[14]。Zhang等[15]發現不同來源T.asahii的過氧化氫酶（catalase，CAT）和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性不同，這些結果表明T.asahii與其他真菌一樣，也具有抗氧化機制。為了進一步研究其抗氧化機制，需要獲得穩定的抗氧化菌株。當細胞暴露于相對溫和、亞致死脅迫刺激后會對隨后的致死性脅迫刺激產生耐受，這種現象不但出現在細菌中，而且也發生在真核生物中，該現象被稱為適應[16]?；谶@一原理，筆者參考真菌耐藥誘導的方法，用亞硫酸氫鈉甲萘醌（menadione sodium bisulfite，MSB）對T.asahii的臨床株和環境株進行體外抗氧化誘導，并進一步研究誘導前后菌株生物學特性的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

T.asahii共2株，T.asahii臨床標準株CBS 2479、環境株CBS 8904均購自荷蘭皇家藝術與科學學院真菌多樣性研究中心（CBS-Knaw）。 藥敏質控標準株：近平滑念珠菌ATCC22019，由北京大學第一醫院真菌研究中心惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

PDA干粉培養基（德國默克公司），蛋白胨干粉和葡萄糖干粉（北京化學試劑有限公司），酵母粉（英國Oxoid公司），MSB（美國Sigma公司），RPMI1640培養基（美國Gibco公司），三氮嗎啡琳丙磺酸（MOPS，美國Sigma公司），總蛋白定量測定盒（微板法）、CAT測定試劑盒（可見光法）、SOD測定試劑盒（WST-1 法）（南京建成生物工程研究所）。

1.3 方法

1.3.1 MSB體外誘導T.asahii制備經傳代純化的單克隆T.asahiiCBS 2479、CBS 8904菌懸液，用細胞計數板調整濃度為1～5×106CFU/ml，取100 μl菌懸液加入10 ml不含MSB的YPD培養液中，37℃振蕩培養10 h后加入MSB使藥物濃度達8 μg/ml（CBS 2479、CBS 8904菌株的1/2MIC MSB）后繼續培養，當培養菌液達到約0.5 U（麥氏）單位時轉至同一藥液濃度的培養液中培養，每一濃度梯度轉種2～3次后再取0.5 U（麥氏）單位菌液100 μl～10 ml含1/2MIC 濃度MSB的YPD液體中培養10 h后再加入MSB使之達最小抑菌濃度（MIC），當培養菌液達到約0.5 U（麥氏）單位時轉至同一藥液濃度的培養液中培養，每一濃度梯度轉種2～3次。如此類推，直至菌株被殺死不再生長，即終止誘導。

對誘導第2代、誘導第4代的菌株檢測總蛋白濃度、CAT、SOD，并行氟康唑、MSB的MIC值測定。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.3.2 MSB誘導菌株的回復性研究 選用32 μg/ml濃度MSB誘導所得的菌株（即誘導第4代）在不含氧化劑的YPD液體培養基中連續傳代10次。對回復第2、5、8、10代的菌株檢測總蛋白濃度、CAT、SOD，并行氟康唑和MSB的MIC值測定。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.3.3 MSB誘導前后T.asahii抗氧化酶活性測定 菌株用細胞計數板配成麥氏比濁度為0.5的菌懸液，取1 ml加到50 ml YPD液體中，37℃振蕩培養48 h（150 r/min）。培養所得菌液用離心機（20℃，3 500 g，10 min）離心，棄去上層培養液，取下層細胞沉淀，無菌水沖洗混勻再離心，重復3次。加入約200 μl裂解緩沖液（磷酸鉀50 mmol/L，pH7.0）并混勻，將菌液轉到含有0.5 g直徑425～600 μm玻璃微珠的小EP管中再懸浮。將混懸液在Fastprep核酸提取儀中以4.0 m/s 的速度強振蕩20 s，冰上冷卻3～5 min，再強振蕩20 s，重復6次。最后1次冰上冷卻后，離心機分離（4℃，16 000 g，10 min），取上層清液用于酶活性的分析。

1.3.4 BCA法測定蛋白質濃度

用標準血清蛋白作對照。用CAT測定試劑盒和SOD測試盒分別測定CAT和SOD活性，具體操作方法按照說明書進行。重復2～4遍。

1.3.5 形態學變化觀察 取誘導前、誘導第4代、回復第10代的2479和8904菌株進行肉眼形態和光鏡下形態學觀察。①肉眼形態： 制備 1×105cfu/ml濃度的T.asahii菌懸液，取5 μl菌懸液接種到固體 PDA培養基上；37 ℃培養 7 d后觀察菌落生長情況。②光鏡形態：制備1×106cfu/ml 濃度的T.asahii菌懸液。分別取 0.5 ml 菌懸液接種于 10 ml YPD 培養基中；37℃、150 r/min 搖床培養 72 h，取少量菌液，乳酸酚棉藍染色后光鏡下觀察。

1.4 統計學方法

實驗數據用SPSS20.0軟件進行分析，兩組間比較采用配對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MSB誘導前后T.asahii抗氧化酶活性變化

CBS 2479誘導前CAT值為46.89 U/mgprot，經MSB誘導后、回復后CAT均值分別為（150.36±62.49）、（82.35±21.13）U/mgprot。CAT 值 經 MSB誘導后比誘導前升高，兩者差異有統計學意義（P＜0.05），回復后比誘導前升高，兩者差異有統計學意義（P＜0.05），回復后比誘導末期下降，兩者差異有統計學意義（P＜0.01）。CBS 8904誘導前CAT值44.06 U/mgprot，經MSB誘導后、回復后，CAT 值分別為（109.69±39.80）、（83.30±6.96）U/mgprot。誘導后的CAT酶活性比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）；回復后比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.01）；回復后比誘導末期下降，兩者差異具有統計學意義（P＜0.01）（表1，圖1，圖2）。

表1 MSB誘導前后T.asahii菌株的抗氧化酶活性

圖1 MSB誘導前后T.asahi的CAT變化

圖2 MSB誘導前后T.asahi的CAT變化

CBS 2479誘導前SOD值為178.54 U/mgprot，SOD值經MSB誘導后、回復后分別為（500.30±181.13）、（577.58±63.71）U/mgprot。SOD 酶 活 性經MSB誘導后比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）；回復后比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.01）；回復后與誘導末期比較，差異無統計學意義。CBS8904誘導前SOD值為226.70 U/mgprot，經MSB誘導后、回復后，SOD值 分 別 為（640.65±195.60）、（719.70±48.23）U/mgprot，誘導后比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），回復后比誘導前升高，兩者差異具有統計學意義（P＜0.01），回復后比誘導末期下降，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖3，圖4）。

圖3 MSB誘導前后T.asahi的SOD變化

圖4 MSB誘導前后T.asahi的SOD變化

2.2 MSB誘導前后T.asahii形態學變化

2.2.1 肉眼形態 各菌株在PDA固體培養基上培養7 d后，觀察可見CBS 2479誘導前乳白色菌落呈放射狀，菌落輪廓呈圓形，中央有多量不規則皺褶，堆積呈珊瑚狀；經MSB誘導后，菌落輪廓呈不規則形，菌落中央不規則皺褶明細變短變少，局部像破了的水皰；回復實驗后，菌落輪廓仍呈不規則形，中央不規則皺褶與誘導末差異不大，CBS 2479-MSB回復菌株中央的不規則皺褶仍短而少（圖5）。

圖5 MSB誘導、回復前后T.asahii菌落形態變化

CBS 8904誘導前菌落輪廓呈不規則形，中央有少量較大的溝回，表面顆粒狀凸起，邊緣呈花瓣狀；經MSB誘導后，菌落輪廓呈類圓形，中央溝回變小、數量顯著增多，顆粒狀凸起增多，菌落中央出現大量不規則皺褶，邊緣整齊；回復后，菌落輪廓呈圓形，菌落中央出現呈同心圓樣的輻射狀輪紋，中央出現較多不規則皺褶，邊緣整齊（圖6）。

圖 6 MSB誘導、回復前后T.asahii光鏡下形態變化

2.2.2 光鏡下形態

CBS 2479菌株誘導前以菌絲為主，MSB誘導末菌絲明顯減少變短，出現較多假菌絲，與孢子混合分布，回復末仍可見少量假菌絲混合在孢子中。CBS 8904菌株誘導前幾乎全為孢子狀態，MSB誘導末以假菌絲為主，僅有少量孢子，回復末仍可見大量假菌絲，中間散在分布少量孢子（圖6）。

3 討論

病原體（包括細菌、真菌和病毒等）侵入機體后，誘導機體進入氧化應激狀態，釋放大量活性氧遞質（reactive oxygen，ROS）來殺滅病原體。ROS主要包括過氧化氫、超氧陰離子、羥自由基、過氧化物等[17]，ROS 的殺傷力非常強，幾乎能破壞所有的生物分子，包括所有病原體[18]，如細菌、真菌、病毒等。ROS主要通過與細胞內成分如蛋白質、脂質、DNA 等發生反應，使細胞嚴重破壞，引起細胞死亡。而病原體為了生存，會啟動自身的一系列抗氧化機制，來對抗機體的氧化殺傷，為它們的侵襲感染和致病創造條件。筆者前期研究發現，常用的3種氧化劑中，甲萘醌對T.asahii的氧化殺傷作用最強[14]。因此，本研究首次應用甲萘醌體外誘導T.asahii，以期獲得T.asahii抗甲萘醌菌株，并觀察誘導前后菌株的生物學特性變化，為下一步抗氧化機制研究奠定基礎。

本研究發現，經MSB誘導后，CBS 2479和CBS 8904的抗氧化酶活性均升高。CBS 2479誘導第4代（即誘導末）CAT值較誘導前升高了4.36倍，而CBS 8904誘導第4代（即誘導末）CAT值則較誘導前升高了3.27倍；CBS 2479誘導第4代（即誘導末）SOD值較誘導前升高了3.68倍，而CBS 8904誘導第4代（即誘導末）SOD值較誘導前升高了3.57倍。本研究結果表明，MSB在體外可以成功誘導T.asahii，并可激活或誘導抗氧化酶活性，使T.asahii的抗氧化能力顯著提高，從而不被宿主免疫系統釋放的ROS殺死，為其今后感染宿主奠定重要基礎。

CBS 2479和CBS 8904回復后，它們的抗氧化酶活性均較誘導末明顯下降，但是仍高于誘導前。CBS 2479回復末CAT值較誘導末下降了3.6倍（P＜0.05），而CBS 2479回復末SOD值則較誘導末僅下降了1.3倍。CBS 8049回復末CAT值較誘導末下降了1.8倍，而CBS 8904回復末SOD值則較誘導末僅下降了1.1倍。提示當去除MSB暴露后，菌株的SOD、CAT值逐漸下降，說明菌株的CAT和SOD的誘導具有可調節性。本研究發現，CBS 2479回復末的抗氧化酶活性較誘導末顯著下降，其CAT值幾乎回復到誘導前水平，而CBS 8904回復末較誘導末有下降，不如CBS 2479明顯，但與誘導前比，仍高1.8倍，提示CBS 2479對MSB干預后可調節性較強，而CBS 8904對MSB干預后可調節性相對較弱。筆者分析，臨床分離株CBS 2479由于之前曾與機體免疫系統等相互作用后激活了其抗氧化能力，因此其抗氧化能力的可調節性較強；而環境分離株CBS 8904未曾進入機體，其抗氧化能力未被激活，因此其抗氧化調節能力相對較弱。

為了生存，真菌常通過形態轉換逃避有害因素的刺激，真菌形態轉換是其重要的毒力或致病因素。本研究發現，CBS 2479和CBS 8904誘導前后其菌落形狀、菌落上溝回或皺褶的形狀、數量以及菌落的質地發生較明顯變化，光鏡下觀察發現其菌絲、孢子之間出現相互轉換。筆者分析認為，在MSB的干預下，T.asahii為了生存，進行形態轉換來應對這種有害刺激。因此，T.asahii在氧化劑MSB的干預下發生形態轉換，不僅是其為了逃避有害因素刺激，而且其毒力或致病性也將發生了變化，為其今后感染宿主創造了重要條件。

總之，筆者通過在體外用MSB對T.asahii的臨床標準株和環境株進行抗氧化誘導，成功誘導出抗氧化菌株，并對抗氧化菌株的穩定性進行了研究，同時觀察了MSB對T.asahii的臨床標準株和環境株形態學的影響。本研究為今后阿薩希毛孢子菌感染的抗氧化機制研究提供了實驗模型，也為T.asahii抗氧化機制的后續研究奠定了重要基礎。