R848聯(lián)合PGE2促成熟樹突狀細胞產(chǎn)生高水平IL-12①

甘 麗 吳學(xué)杰 申五一 劉友山 俞凱莉

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容中心，杭州310003)

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是專職抗原提呈細胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要作用。此外，它們是唯一能啟動初始T細胞免疫應(yīng)答的抗原提呈細胞[1]。目前，誘導(dǎo)未成熟DCs的體外培養(yǎng)方案已經(jīng)很成熟[2-4]，并且開發(fā)了多種促進DCs成熟的方案，其中IL-1β、IL-6、TNF-α加前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)方案已成為“標準的”DCs促成熟方案[5]。但該方案促成熟DCs僅產(chǎn)生極少量的IL-12p70，而該細胞因子在誘導(dǎo)Th1類應(yīng)答中具有重要作用，因此有必要開發(fā)新的促進DCs成熟的方案。有研究發(fā)現(xiàn)單用瑞喹莫德(Resiquimod，R848),可以刺激未成熟DCs產(chǎn)生較高水平IL-12p70[6]。此外，PEG2在促進成熟DCs遷移性方面發(fā)揮重要作用[7]。然而，同時給予R848和PGE2刺激后，未成熟DCs細胞表型和功能變化尚不清楚。在本研究中，我們采用R848聯(lián)合PGE2刺激未成熟DCs，并與標準方案促成熟DCs進行比較，以確定該方案誘導(dǎo)的成熟DCs在表型和功能方面是否優(yōu)于標準方案誘導(dǎo)的成熟DCs。

1 材料與方法

1.1材料 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)，CD14 Microbeads(Miltenyi Biotec)，AIM-V培養(yǎng)基(Gibco)，絲裂霉素C(Roche)，rh粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、rhIL-4、IL-1β、IL-6、TNF-α(PeproTech)，R848(Alexis)，Dextran-FITC、PGE2、豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和離子霉素(Sigma)，Annexin V-PE、7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)、Cytofix/Cytoperm kit、FITC-IFN-γ、PE-IL-4、CD40-FITC、CD86-FITC、CD80-PE、CD83-PE、CXCR4-PE、HLA-DR-Percp和相應(yīng)的同型對照(BD Biosciences)，CCR7-FITC及同型對照(eBioscience)，CellTiter 96?AQueous無放射性試劑(Promega)，ELISA試劑盒(Biolegend)，F(xiàn)lowJo 軟件(版本 5.7.2，Tree Star Inc.)。FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)，二氧化碳細胞孵育箱和生物安全柜(中國香港力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)后用磁珠分選CD14+單核細胞 使用Ficoll-Paque Plus梯度離心法從健康人外周血(外周血來自課題組成員，每次血量約20 ml)分離PBMCs。然后用人CD14+磁珠從PBMCs中分選CD14+單核細胞。CD14+單核細胞分選純度大于90%。……