加味益氣聰明湯對Aβ1-42誘導HBMEC細胞凋亡的保護作用及機制研究

黃江 楊云芳（通訊作者） 周姜 白雪 趙福蘭

（西南醫科大學附屬中醫醫院 四川 瀘州 646000）

阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病，發病機制復雜，患者生存率低，目前尚無有效的藥物能夠治愈該疾病[1]，給社會和家庭帶來了極大的負擔。Aβ的沉積導致腦血管內皮損傷可能是AD發病機制之一，可能與Aβ致血管內皮細胞細胞凋亡，產生炎癥反應有關[2]。TLR4是機體參與炎癥信號的重要受體之一[3]，特異性配體可以激活TLR4與COX-2信號通路，釋放炎癥因子IL-1、TNF-α[4]。

加味益氣聰明湯主要含黃芪、人參、葛根、石菖蒲、遠志等中藥，現代研究表明其具有神經功能保護作用[5]，對阿爾茨海默病具有一定的改善作用。據此筆者通過體外培養HBMEC，研究加味益氣聰明湯是否能減輕Aβ1-42誘導的HBMEC凋亡，探討其保護效應與TLR4/COX-2表達的關系，為加味益氣聰明湯臨床用于AD治療提供分子藥理學依據。

1.材料

1.1 儀器

電泳轉膜儀；超凈工作臺；酶標儀；激光掃描顯微鏡；流式細胞儀。

1.2 藥品與試劑

加味益氣聰明湯按要求提取純化并制成每1ml相當于原藥材1g的藥液；CCK-8試劑盒；兔TLR4、COX-2多克隆抗體；Aβ1-42；TAK242；Hochest33342、FITC。

1.3 細胞

人腦微血管內皮細胞株（HBMEC）。

2.方法

2.1 細胞活力的測定

將各組細胞均加入50μmol·L-1Aβ1-42培養24h，同時加味益氣聰明湯各濃度組加入相應濃度的藥液作用30min，24h后加入CCK-8 10μL繼續培養1h。酶標儀450nm波長處測定光密度（OD），以OD值的大小評價細胞活力。

2.2 細胞凋亡情況的檢測及凋亡率的測定

同“2.1”項下分組、給藥培養24h后，Hochest 33342/PI雙染檢測HBMEC凋亡情況，藍色為正常細胞，亮藍色為凋亡細胞，紅色為死亡細胞；培養24h后收集細胞，冷PBS洗2次，懸浮于緩沖液中，取100μL細胞懸液加5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI，室溫暗置15min，流式細胞儀測定凋亡率。

2.3 細胞中TLR4、COX-2蛋白表達的測定

同“2.1”項下分組給藥培養24h，裂解10min，低溫離心10min，取上清液備用。采用BCA法測定蛋白濃度。

2.4 統計學方法

3.結果

3.1 細胞活力

陰性對照組、對照組和加味益氣聰明湯各濃度組細胞的OD值測定結果見表1，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組細胞活性及凋亡率檢測結果 （）

表1 各組細胞活性及凋亡率檢測結果 （）

注：對照組與陰性對照組比較，*P＜0.05；藥物組與對照組比較，#P＜0.05。

組別 細胞活力OD值 細胞凋亡率（%）陰性對照組 0.99±0.12 0.97±0.11對照組 0.79±0.07* 19.69±0.08*加味益氣聰明湯低濃度組 0.92±0.04# 10.32±0.06#加味益氣聰明湯中濃度組 0.97±0.03# 5.02±0.02#加味益氣聰明湯高濃度組 0.99±0.07# 2.11±0.04#

3.2 細胞凋亡情況及凋亡率

Hochest雙染結果顯示，陰性對照組細胞呈圓形，細胞核呈淡藍色，幾乎無凋亡細胞；對照組多數細胞細胞核呈亮藍色，提示凋亡細胞較多，偶見紅色細胞核的死亡細胞；加味益氣聰明湯高濃度組凋亡細胞較少，加味益氣聰明湯中、低濃度組可見少量凋亡細胞。

流式細胞儀測定結果顯示，與陰性對照組比較，對照組細胞的凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，加味益氣聰明湯各濃度組細胞的凋亡率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），各組細胞凋亡率檢測結果見表1。

3.3 細胞中TLR4、COX-2 蛋白表達

與陰性對照組比較，對照組細胞中TLR4、COX-2蛋白表達明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，加味益氣聰明湯各濃度組細胞中TLR4、COX-2蛋白表達均明顯減弱，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。各組細胞中TLR4、COX-2 蛋白表達測定結果見表2。

表2 各組細胞中TLR4、COX-2 蛋白表達的測定結果（）

表2 各組細胞中TLR4、COX-2 蛋白表達的測定結果（）

注：對照組與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；藥物組與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 TLR4/β-actin值 COX-2/β-actin值陰性對照組 0.71±0.11 0.83±0.11對照組 0.94±0.06** 1.11±0.08**加味益氣聰明湯低濃度組 0.88±0.03## 0.95±0.04##加味益氣聰明湯中濃度組 0.81±0.04## 0.92±0.02##加味益氣聰明湯高濃度組 0.72±0.04## 0.86±0.06#

4.討論

Toll受體是機體重要的識別受體之一，目前發現的Toll樣受體約有12種[6]。其中TLR4是識別特異性配體LPS，參與炎癥信號的重要受體之一。TLR4激活后，會激活下游COX-2通路，釋放炎癥因子參與炎癥反應[7]。有資料顯示，AD的血管內皮細胞凋亡可能與TLR4的參與關系密切[8]，LPS啟動的TLR4通路參與了AD的發生[9]。另有研究發現，TLR4缺乏的小鼠較TLR4野生型小鼠更容易發生淀粉樣沉積和彌散。由此可知，TLR4可能與AD發生過程中內皮細胞損傷存在一定關聯。

研究發現加味益氣聰明湯對改善AD神經功能癥狀具體一定的療效[10]，可能對Aβ1-42誘導的HBMEC細胞凋亡具有保護效應。本次實驗結果顯示，Aβ1-42刺激HBMEC后，細胞凋亡明顯增加，細胞活力下降；與對照組比較，加味益氣聰明湯作用后減少了Aβ1-42誘導的血管內皮細胞凋亡率，提高了細胞活力，因此加味益氣聰明湯對Aβ1-42誘導的HBMEC凋亡具有一定的保護效應。進一步研究結果顯示，加味益氣聰明湯作用后減少了Aβ1-42誘導的HBMEC中TLR4、COX-2蛋白表達，推測其對AD的保護效應可能與抑制TLR4、COX-2 蛋白表達有關。

綜上所述，加味益氣聰明湯對Aβ1-42誘導的HBMEC細胞凋亡具有明顯的保護效應，其保護效應可能與抑制TLR4啟動的信號通路中COX-2蛋白表達有關，但其他的Toll受體是否也參與了加味益氣聰明湯的保護作用值得進一步研究。