油菜籽對小鼠結直腸癌的預防作用

袁海鋒 陳東波 張建華 劉增福 劉慧亞 劉慶民

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，在我國，近年來隨著生活水平的提高，飲食結構和生活方式的改變，結直腸癌的發病率逐年升高，發病年齡呈現年輕化的趨勢，預后不佳，總體生存率在50%左右[1-3]。因而，結直腸癌的預防成為最近研究的焦點[4-5]。流行病學研究發現，十字花科蔬菜能降低結直腸癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的患病風險[6-8]。油菜籽（rapeseed，RS）是十字花科蔬菜油菜的種子，含有豐富的脂肪酸、磷脂、多酚、維生素E、硫代葡萄糖苷、纖維素、植酸、黃銅等多種化學成分。研究發現，油菜籽具有殺菌消炎、抗衰老、抗過敏、抗癌防癌等功效[9]，但其對結直腸癌的預防作用還沒有相關文獻報道。本課題旨在研究油菜籽對小鼠結直腸癌的預防作用，以期為油菜籽應用于腫瘤的防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 致癌劑氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）購自美國Sigma公司，臨用前用生理鹽水配制，終濃度為1.25 g/L。

1.1.2 實驗動物 2018年4月—2019年3月，選取清潔級昆明種小鼠和和基礎飼料購自菏澤醫專實驗動物中心，油菜籽（rapeseed，RS）購自菏澤某種子公司，在動物中心將油菜籽和基礎飼料混勻，加工制成含2.5% RS和5% RS的飼料。昆明種小鼠80只，體質量18～20 g，適應性喂養1周，第2周開始實驗。動物飼養環境溫度為22℃～25℃，濕度為40%～70%，自由飲水，自然光照。

1.1.3 醫學倫理學 該研究項目實施前報請經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理 將80只昆明種小鼠隨機分為5組，分組如下：（1）AOM模型組（20只）：以無菌生理鹽水將AOM溶解，腹腔注射10 mg/kg體質量，每周1次，共6次，基礎飼料飲食；（2）AOM+2.5% RS低劑量預防組（20只）：AOM誘發腫瘤同時給予含2.5% RS飼料飲食；（3）AOM+5% RS高劑量預防組（20只）：AOM誘發腫瘤同時給予含5% RS飼料飲食；（4）正常對照組（10只）：給予等體積生理鹽水腹腔注射，基礎飼料飲食；（5）單純油菜籽組（10只）：給予等體積生理鹽水腹腔注射，含5% RS飼料飲食。

1.2.2 觀察指標和取材 觀察各組小鼠的一般狀態，包括營養狀況、活動狀態、大便性狀、精神狀態、毛發光滑程度，記錄體重。第36周實驗結束，處死小鼠，解剖腹腔，取出結直腸，沿腸系膜縱向剖開，用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干，觀察有無腫瘤發生，計算腫瘤發生率。經肉眼判斷為腫瘤或疑似腫瘤的標本用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，由2名經驗豐富的病理醫師閱片確診。

1.3 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，多組間均數比較選用LSD-t檢驗；計數資料選用χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀態觀察

正常對照組和單純油菜籽組小鼠在整個實驗過程中，反應靈敏，皮毛光滑，飲食和精神狀態良好；AOM模型組小鼠20周后部分小鼠出現攝食量減少，皮毛粗糙無光澤，28周時，大部分小鼠出現活動減少，精神狀態差，體質量下降，36周時，部分小鼠出現腹部明顯膨隆，便血，個別小鼠發生腹水；各油菜籽預防組小鼠一般狀態好于腫瘤模型組小鼠。

2.2 體質量

實驗期初，各組小鼠體質量差異無統計學意義。實驗期末，單純油菜籽組與正常對照組比較，體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；腫瘤模型組體質量低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量和高劑量預防組體質量均高于腫瘤模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1各組小鼠體質量變化比較（g，±s）

表1各組小鼠體質量變化比較（g，±s）

注：與實驗初相比，*P＞0．05，與腫瘤模型組相比，#P＜0．05

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2.3 肉眼觀察

正常對照組和單純油菜籽組小鼠結直腸粘膜光滑平整，未見腫瘤及其它病變。腫瘤模型組和各油菜籽預防組小鼠結直腸粘膜發現大小不一、數量不等的腫瘤結節，主要分布在距肛門8 cm以內的腸段，結節多為圓形、橢圓形，多數直徑約2～3 mm，表面光滑、質韌，少數腫物表面可見潰爛。

2.4 腫瘤發生情況

在小鼠的結直腸中發現1個及以上腫瘤，即判定該小鼠發生結直腸癌。正常對照組和單純油菜籽組均未發生腫瘤；腫瘤模型組結直腸癌發生率90%（18/20），低劑量預防組發生率為45%，高劑量預防組發生率45%（9/20），三組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；腫瘤模型組小鼠平均腫瘤數與低劑量預防組、高劑量預防組平均腫瘤數比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠腫瘤發生率和平均腫瘤數目比較

2.5 病理組織學檢查

正常對照組和單純油菜籽組小鼠腸粘膜腺體排列規整，固有層炎癥細胞少見。實驗中誘發的結直腸腫瘤多數為高分化管狀腺癌，腺體結構紊亂，大小不一，腺腔不規則，腺上皮異型增生明顯。

3 討論

動物腫瘤模型是目前研究腫瘤預防常用的重要工具。結直腸癌常用的動物模型是化學致癌，與人類結直腸癌發生過程非常相似，其中研究最成熟和最為常用的是氧化偶氮甲烷聯合葡聚糖硫酸鈉建立小鼠結直腸癌動物模型（azoxymethane，AOM）[10]。AOM是DMH的代謝中間產物，具有比DMH更強的致癌性和化學穩定性，已經成為經典的致癌劑。它是一種強氧化劑，通過對細胞膜以及DNA過氧化損傷，誘發結直腸粘膜上皮細胞癌變[11-12]。

本實驗以AOM誘導小鼠結直腸癌模型，飲食中給予不同劑量的油菜籽進行干預，觀察油菜籽對結直腸癌發生的預防作用。實驗結果顯示，AOM模型組小鼠腫瘤發生率為90%，與AOM模型組相比，低劑量預防組小鼠腫瘤發生率降低30%，高劑量預防組小鼠腫瘤發生率降低45%，組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。同時，低劑量預防組和高劑量預防組每只小鼠平均帶瘤數較腫瘤模型組減少（P＜0.05）。實驗結果表明，在食物中添加油菜籽可以預防AOM誘導的結直腸癌，隨著油菜籽濃度的增加，其預防作用增強。

本研究證實，油菜籽對結直腸癌具有一定的預防作用，其確切的作用機制還不清楚，目前國內外還沒有相關文獻報道。油菜籽在我國產量很大，主要用于生產菜籽油。本課題組正在對油菜籽進行活性成分提取，下一步深入研究它抗癌防癌的作用機制，為其未來應用于腫瘤的防治提供實驗依據。