家族血栓與抗凝血酶Ⅲrs2227589突變研究

王海平 張素平 闕敢波 張奕平 劉全芳 張洪彬

靜脈血栓（venous thromboembolism，VTE）是臨床常見的一種疾病[1]，現有流行性學數據顯示亞洲地區VTE的病發率在14～57/1 000 000人/年[2-6]。人體抗凝系統與纖溶系統共同維持機體出血和缺血之間的平衡。其中，抗凝血酶（antithrombin，AT）作為是抗凝系統重要的組成成員，是超大家族蛋白質酶抑制劑-絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，Serpins）的一種。AT通過中和凝血途徑中的凝血酶、因子（F）Ⅹa、FⅨa、FⅪa、FⅫa等發揮抗凝作用[7]，有研究顯示，SERPINC1 rs2227589位點基因突變增加深靜脈血栓風險（OR 1.29，95%Cl 1.10～1.49）[8]，但中國人群少見報道，尤其是針對家族體系。現我們報道福建龍巖地區一個家族四代SERPINC1 rs2227589位點基因突變與VTE的研究。

1 對象與方法

1.1 家系基礎資料

先證者，女，漢族，48歲，BMI：21.48 kg/m2，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，無傳染病、過敏史，無抽煙、飲酒，肝腎功能正常，已婚（育有一女一子，均健康）。主訴月經淋漓不盡25天，入院陰道彩超診斷子宮肌瘤（6.5 cm×7.4 cm），2017年6月26日行“經腹全子宮加雙側輸卵管切除術”，術前用藥頭孢唑啉，術后鈉鉀鎂鈣注射液500 mL、5%葡萄糖注射液500 mL+維生素C注射液2.0 g+維生素B6注射液0.2 g、復方氨基酸注射液250 mL、5%葡萄糖氯化鈉注射液500 mL補液，術后第4天患者訴右下肢小腿處腫脹，多普勒超聲診斷為“右下肢深靜脈血栓形成”（見圖1），當日抗凝藥師會診醫囑穿彈力襪，口服華法林鈉鈉片2.5 mg，每晚一次，口服+達肝素鈉注射液5 000 IU皮下注射q12h橋接，2017年7月4日：INR：1.31，調整華法林劑量為3.125 mg，每晚一次，口服。2017年7月10日：INR：1.65，調整華法林鈉片劑量為3.75 mg，每晚一次，口服。2017年7月17日，復查INR：2.22，多普勒超聲復查診斷“右下肢深靜脈血栓形成”（見圖2），維持華法林鈉片3.75 mg，每晚一次，口服，停用達肝素鈉注射液，患者出院，門診隨訪治療。

圖1 先證者2017年6月30日術后第四天多普勒彩超圖（下肢深靜脈）

圖2 先證者2017年7月17日多普勒彩超圖（右下肢深靜脈）

抗凝門診治療情況如下：2017年7月24日：INR：2.48（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年8月8日：INR：2.01（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年8月24日：抗凝門診復查INR：2.19（華法林3.75 mg，每晚一次，口服），患者主訴右小腿偶有腫脹感，多普勒超聲復查診斷“雙下肢無深靜脈血栓形成”（見圖3）。2017年9月26日，INR：2.69（華法林3.75 mg，每晚1次，口服），患者訴右小腿無腫脹不適感。2017年10月31日，INR：2.21（華法林3.75 mg，每晚一次，口服）。2017年12月4日，INR：2.21（華法林3.75 mg，每晚1次，口服）。2018年1月5日，INR：2.01，患者抗凝治療療程已足，停止抗凝治療停用華法林。

圖3 先證者2017年8月24日多普勒彩超圖（雙下肢深靜脈）

先證者的哥哥：BMI：22.37 kg/m2，平素體健，無抽煙、飲酒等嗜好，20年前無外傷、手術等誘因發生右下肢深靜脈血栓，18年前再次無誘因發生腸系膜血栓，17年前無誘因發生肺栓塞經搶救無效死亡。

先證者的舅舅：BMI：24.31 kg/m2，平素體健，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，肝腎功能正常，偶有飲酒，無抽煙等不良嗜好，無誘因反復右下肢深靜脈血栓史（2006年12月診斷為右下肢深靜脈血栓，華法林抗凝治療半年腫脹消退；2009年3月再次診斷為右下肢深靜脈血栓，華法林抗凝治療后腫脹消退；2013年11月第三次診斷為右下肢深靜脈血栓），2017年5月18日因右下肢靠近腳踝處潰瘍就診我院門診，門診診斷：右下肢腳踝潰瘍，右下肢深靜脈血栓形成后遺癥。多普勒彩超顯示“右側髂靜脈及右下肢靜脈深靜脈陳舊性血栓栓塞” （見圖4），目前華法林鈉片3.75 mg每晚一次，口服抗凝治療。

圖4 先證者舅舅2017年5月18日多普勒彩超圖（右下肢深靜脈）

圖6 先證者INR監測統計圖

圖5 遺傳性AT缺陷癥家系圖

先證者的表弟：BMI：21.51 kg/m2，平素體健，無高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，肝腎功能正常，無抽煙、飲酒等不良嗜好，無誘因反復兩次右下肢深靜脈血栓史（2004年5月右下肢深靜脈血栓，經華法林抗凝治療1年；2011年右下肢深靜脈血栓形成），長期華法林抗凝5 mg，每晚1次。遺傳性AT缺陷癥家系圖，如圖5。

本研究內容獲院內倫理委員會批準，所有家族成員均簽署知情同意書。

1.2 生化指標檢測

收集18位家族成員外周血進行生化分析，包括血液細胞分析（日本Sysmex2100型血球儀）；肝功能8項（羅氏原裝肝功能8項檢測試劑盒，羅氏c501全自動生化儀）、腎功能5項（羅氏原裝腎功能5項檢測試劑盒，羅氏c501全自動生化儀）；凝血四項與D-D二聚體檢測（檢測方法：凝固法，上海博研試劑盒，美國貝克曼公司型號為ACL TOP 700全自動血凝儀）；蛋白C活性、蛋白S活性、AT活性（檢測方法：發色底物法，上海博研蛋白C檢測試劑盒，上海博研蛋白S檢測試劑盒，上海博研AT-Ⅲ檢測試劑盒，美國貝克曼公司ACL TOP700全自動血凝儀）。

1.3 SERPINC1 rs2227589基因突變檢測

收集18位家族成員外周血進行SERPINC1全基因測序。PCR 反 應 體 系 10 μL：Premix prime STAR 5 μL，ddH2O 3 μL，引物工作液 1 μL，樣品DNA 1 μL，PCR過程：95℃ 3 min，95℃ 30 s、68℃ 15 s、72℃ 60 s，20 cycles，95℃ 30 s、58℃ 15 s、72℃ 60 s，16 cycles，72℃ 10 min，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳、割膠后，用瓊脂糖DNA純化試劑盒（上海申能博彩公司）回收并純化，末端標記雙脫氧法進行正向和/或反向測序，使用Chromas軟件將SERPINC1測序結果與Genbank序列X68793. 1作比對分析，對所發現的基因突變，重新PCR擴增相應的片段，反向測序證實。

2 結果

2.1 先證者抗凝治療監測

先證者因經腹全子宮加雙側輸卵管切除術后深靜脈血栓，口服華法林抗凝治療半年，服藥期間患者依從性好，INR持續控制在2.0～3.0（見圖6）。

2.2 家族成員生化指標檢測結果

生化指標顯示，包括先證者在內的多數家族成員APTT、PT、Fg、TT、蛋白酶C、S活性均正常。其中，先證者、先證者的母親（Ⅱ-1）、弟弟（Ⅲ-5）、表弟（Ⅲ-2）、表弟的女兒（Ⅳ-2）、兒子（Ⅳ-4）的抗凝血酶活性AT：A（%）略有下降；舅舅（血栓患者Ⅱ-3）和表弟（血栓患者Ⅲ-1）抗凝血酶活性AT：A（%）下降明顯，詳見（表1）。

表1 遺傳性缺陷 AT 家系先證者及家系成員生化檢測

2.3 家族成員SERPINC1 rs2227589基因突變檢測結果

SERPINC1基因檢測經正反測序證實，采用Chromas軟件分析： 家族18名成員中有8位成員在rs2227589位點存在基因突變：?先證者、先證者的母親（Ⅱ-1）、舅舅（血栓患者Ⅱ-3）、弟弟（Ⅲ-5）、表弟（血栓患者Ⅲ-1）、表弟（Ⅲ-2）、表弟的女兒（Ⅳ-2）、兒子（Ⅳ-4）（rs2227589位點存在基因雜合突變），見圖7。

圖7 SERPINC1 rs2227589基因突變檢測

3 討論

目前，國內外研究逐步開始關注SERPINC1 rs2227589位點突變與AT活性及不良事件的相關性。Antón AI等[9]研究298例高加索健康人群中SERPINC1 rs2227589基因突變情況，發現A等位基因攜帶者相較于GG基因型人群具有較低的抗凝活性（97.0±7.3%vs.94.6±8.4%；P=0.032；99.5±5.8%vs. 94.8±5.6%；p=0.001）。Guerra-Shinohara EM等[10]納入117例復發性流產女性與265例健康女性研究顯示SERPINC1 rs2227589位點突變，增加女性復發性流產風險（OR：1.77，95%CI：1.05～3.00，P=0.034）。王強等[11]在骨科關節置換、植入物置入等較大創傷型手術后靜脈血栓前狀態的基因預測診斷的論述中強調骨科術后VTE的發生需要關注遺傳方面的致病基因，早預防，早治療。孫玉發等[12]在老年人群冠心病易感基因的研究中，納入246例冠心病患者于185例健康人群對比，發現攜帶SERPINC1 rs2227589位點突變基因的個體相較于野生型，冠心病風險增加（OR=1.79，CI：1.22～2.63，P=0.003）。SERPINC1 rs2227589位點基因突變將影響AT活性，進而影響機體抗凝系統穩態，增加血栓風險，在有血栓家族史的人群中將會表現的更為明顯。

本研究報道了一例家族四代SERPINC1 rs2227589位點基因突變與VTE的研究。家族成員中有7位SERPINC1 rs2227589位點存在突變，且除了先證者以外，確診的反復VTE成員（Ⅱ-1、Ⅲ-1）均是SERPINC1 rs2227589位點突變攜帶者，考慮SERPINC1 rs2227589位點是該家族血栓高發的易感因素。介于本研究家族體系人數的限制，后續擬將擴大人群樣本，在中國人群中對SERPINC1 rs2227589基因多態性與VTE發生風險進行研究，可能將為VTE的預防和治療做一提示。