丹紅注射液對大鼠深靜脈血栓形成模型的作用研究

劉麗亞，薛云，戴曉莉

(1．南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院，廣東深圳518110;2．山東省藥學科學院，山東濟南250100)

丹紅注射液是由丹參和紅花提取分離的復方中藥制劑。丹紅注射液的主要功效為活血化瘀和通脈舒絡，臨床上用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風、冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦血栓等［1-4］。盡管中藥注射液在國內(nèi)臨床上應用廣泛，但其療效不確切，安全事故頻發(fā)，故國內(nèi)外對中藥注射液爭議較大。2017年深化藥品器械醫(yī)療審評審批制度改革的重點工作之一就是中藥注射液的有效性和安全性再評價工作。本實驗室按照中藥注射劑再評價要求，采用下腔靜脈阻斷法制備大鼠靜脈血栓模型，通過檢測出血時間、血漿纖維蛋白原含量、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和血栓重量等指標，全面考察丹紅注射液對大鼠下腔靜脈阻斷血栓模型的改善作用，以期為丹紅注射液的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1．1 動物 SD大鼠200～220g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。SPF級動物房［SYXK(魯)2014-0008］飼養(yǎng)。溫度20～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)8～10次/h，動物自由飲食飲水。

1．2 藥品與試劑 丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司提供，批號：150832);阿加曲班注射液(天津藥物研究院藥業(yè)有限責任公司，批號：20150634);纖維蛋白原、凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間試劑盒均由上海太陽生物技術有限公司提供。

1．3 儀器 AY220型電子分析天平(島津有限公司);C2000型血凝儀(北京東方普利生科貿(mào)有限公司);TDL-5臺式低速大容量離心機(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

2 方法

2．1 劑量設計 丹紅注射液臨床用法為成人每天8 mL。按成人70kg和200g大鼠等效劑量折算系數(shù)法可得大鼠用藥劑量為 8mL×0．018×5=0．72 mL·kg-1，故本試驗可設丹紅注射液低、中、高劑量分別為 0．5、1、2mL·kg-1。

2．2 大鼠深靜脈血栓形成模型的建立［4-5］取健康雄性大鼠60只，按體重隨機分為6組，分偽手術組、模型組、丹紅注射液 2、1、0．5mL·kg-13 個劑量組和阿加曲班注射液1．8mg·kg-1陽性對照組。手術前所有動物禁食12h，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，仰臥固定，備皮消毒，于下腹部正中縱行3～4cm切口打開腹腔，分離腹主動脈和下腔靜脈，將4號絲線與下腔靜脈并行，用Prolene線將腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈與絲線一起結扎，并在結扎線下方用血管阻斷夾夾住血管，然后將絲線抽出后取下血管阻斷夾。手術完成后關閉腹腔，術后仔細護理至大鼠清醒。偽手術組所有操作同模型組，但不結扎和夾閉血管。造模后各給藥組尾靜脈給予相應劑量的藥物溶液，10mL·kg-1，每天給藥1次，連續(xù)給藥3d，模型組和偽手術組給予等容積的生理鹽水。

2．3 指標檢測［4-5］給藥前和末次給藥后5h，用鋒利的刀片橫切大鼠尾部5mm，每30s用濾紙吸去，直至出血停止，記錄出血時間。藥后6h，重新打開腹腔，從后腔靜脈上段取血，測定活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)及凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原含量(FIB)。取血同時，在結扎下方2cm處夾閉管腔，取出瘀血段血管，剖開管腔，取出血栓，放在濾紙上，吸干血液，稱取血栓濕重(mg)，然后將血栓置培養(yǎng)皿中在室溫下放置24h，稱取血栓干重(mg)。

2．4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學方法 采用DAS2．0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。各組實驗數(shù)據(jù)采用表示，組間指標數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。采用P＜0．05或0．01表示統(tǒng)計差異性。

3 結果

3．1 對模型大鼠出血時間的影響 偽手術組大鼠給藥前后出血時間未見明顯變化，模型組大鼠造模后出血時間一定程度降低，但未見統(tǒng)計學差異。丹紅注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后出血時間與給藥前比較均顯著延長(P＜0．05或 P＜0．01)。丹紅注射液 2 mL·kg-1與阿加曲班注射液1．8mg·kg-1劑量組大鼠的出血時間未見統(tǒng)計學差異(P＞0．05)，而丹紅注射液1、0．5mL·kg-1劑量組大鼠出血時間明顯短于阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1劑量(P＜0．05 或 P＜0．01)，結果見表 1。

表1 丹紅注射液對模型大鼠出血時間的影響(，n=10)

表1 丹紅注射液對模型大鼠出血時間的影響(，n=10)

注：與給藥前比較，*P＜0．05，＊＊ P＜0．01;與給藥前比較，#P＜0．05，##P＜0．01

組別 劑量 給藥前出血時間/s給藥后出血時間/s偽手術 - 477±226 495±211模型 - 462±129 376±151阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 488±135 962±167＊＊2mL·kg-1 447±147 853±137＊＊丹紅注射液 1mL·kg-1 480±138 722±120*#0．5mL·kg-1 459±148 583±139##

3．2 對模型大鼠凝血時間和血漿纖維蛋白原含量的影響 與偽手術組比較，模型大鼠血漿纖維蛋白原含量升高，凝血時間延長。與模型組比較，丹紅注射液 2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1劑量組大鼠給藥后TT、APTT和PT顯著延長，血漿纖維蛋白原含量明顯降低(P＜0．05或 P＜0．01)，結果見表2。

表2 丹紅注射液對模型大鼠凝血時間和纖維蛋白原含量的影響(，n=10)

表2 丹紅注射液對模型大鼠凝血時間和纖維蛋白原含量的影響(，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01;與偽手術組比較，##P＜0．01

組別 劑量 APTT/s PT/s TT/s FIB/g·L-1偽手術 - 21．3±1．1 12．3±1．3 30．7±1．2 1．84±0．45模型 - 19．6±1．8# 11．0±0．8# 29．2±1．0# 2．68±0．36##阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 24．5±0．9＊＊ 16．8±1．4＊＊ 35．9±1．2＊＊ 1．78±0．24＊＊2mL·kg-1 22．9±1．9＊＊ 15．8±1．2＊＊ 33．8±1．5＊＊ 1．91±0．32*丹紅注射液 1mL·kg-1 21．5±1．4* 13．2±1．7* 31．9±1．6* 2．03±0．27*0．5mL·kg-1 20．4±1．3 11．9±1．2 29．8±1．5 2．22±0．46

3．3 對模型大鼠血栓重量的影響 偽手術組未見血栓形成，模型大鼠出現(xiàn)明顯血栓。與模型組比較，丹紅注射液2、1mL·kg-1和阿加曲班注射液1．8 mg·kg-1劑量組大鼠給藥后血栓濕重和干重均明顯降低(P＜0．05 或 P＜0．01);而丹紅注射液 0．5 mL·kg-1劑量組大鼠血栓重量亦有所降低，但未見統(tǒng)計學差異。結果見表3。

表3 丹紅注射液對模型大鼠血栓重量的影響，n=10)

表3 丹紅注射液對模型大鼠血栓重量的影響，n=10)

注：與模型組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01

組別 劑量 血栓濕重/g 血栓干重/g偽手術 - - -模型 - 20．9±3．8 5．4±1．3阿加曲班注射液 1．8mg·kg-1 14．2±2．9＊＊ 3．4±1．1＊＊2mL·kg-1 16．5±3．2* 3．6±0．9＊＊丹紅注射液 1mL·kg-1 18．1±1．8* 4．0±0．8*0．5mL·kg-1 19．1±2．8 4．5±0．6

4 討論

利用大鼠制備深靜脈血栓形成(DVT)動物模型已有60多年的歷史，共有18種動物可用于DVT的模型制備。大鼠與犬、豬等實驗動物相比復制DVT模型具有重復性好、費用低等優(yōu)點，故采用較多。腎靜脈血栓形成最重要的3個因素為血流淤積、靜脈內(nèi)皮損傷及血液高凝集。因此要圍繞這3種因素，選擇合適的處理方式進行DVT模型制備。通過接扎靜脈模擬血流淤積是最簡便、應用最多模型制備方式。本文通過縮窄下腔靜脈，同時血管阻斷夾阻斷并結扎腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈各屬支的方法，建立了大鼠DVT疾病模型［6］。結果顯示，模型組大鼠凝血時間縮短，纖維蛋白原含量升高，出現(xiàn)明顯的血栓，證明模型制備成功。

預測血栓形成的獨立危險因素之一就是纖維蛋白原，纖維蛋白原水平升高后心血管事件的發(fā)生率亦明顯升高。纖維蛋白原為血液中含量最高的凝血因子，其含量升高可明顯促進血液凝固和血小板聚集。纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白和不溶性降解產(chǎn)物后啟動血栓形成的過程;纖維蛋白原和紅細胞均為決定血液黏度的最重要因素，其水平升高可增加血漿黏度和改變血流變指標，進而促進血栓形成［7］。本試驗結果證明，模型組纖維蛋白原含量明顯升高，丹紅注射液1mL·kg-1劑量以上可顯著降低纖維蛋白原含量，延長出血和凝血時間，明顯降低模型大鼠腎靜脈血栓干重和濕重，對腎靜脈血栓形成有明顯的抑制作用。其作用機制可能為通過其有效成分迷迭香酸、丹參酚酸和對香豆酸來抑制多個誘導血小板黏附、聚集及其下游鈣離子和cAMP信號通路的G蛋白耦聯(lián)受體激動劑而發(fā)揮作用［8-9］。