栝樓不同藥用部位質量控制的研究進展

穆向榮，林林，焦陽，林永強

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101)

瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞、天花粉分別來源于葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim．)或雙邊栝樓(Trichosanthes rosthorniiHarms)的干燥成熟種子、果皮、果實和根。瓜蔞子具有潤肺化痰，滑腸通便的功效;瓜蔞皮具有清熱化痰，利氣寬胸的功效;瓜蔞具有清熱滌痰，寬胸散結，潤燥滑腸的功效;天花粉具有清熱瀉火，生津止渴，消腫排膿的功效。在二母寧嗽丸、止咳橘紅丸、乙肝益氣解郁顆粒和降甲糖片等中成藥中用量很大。這4味藥材的質量標準均收載于《中國藥典》2015年版，質量標準的控制項目少，不能有效地控制藥材的安全性和有效性，制約了該類飲片和相關制劑的質量控制和臨床應用。當前，有文獻對其外源性污染物進行報道，瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞、天花粉有效組分的種類、化學成分、藥理作用的文獻也常見，但都片面地反映了藥材的安全有效。本文首次圍繞栝樓不同藥用部位的內源性、外源性污染物含量測定，有效組分的化學成分、提取及分離純化方法、含量測定等研究展開綜述，為瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉質量標準的完善奠定理論基礎。

1 瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉安全性的研究

中藥安全分內源性和外源性兩方面，包括中藥自身有毒有害成分、重金屬污染、微生物污染、農藥殘留污染、二氧化硫、有機污染物以及中藥摻假等。瓜蔞和天花粉的安全性研究報道較多。據報道，天花粉中的葫蘆素B雖然具有明確的抗肝炎、抗腫瘤活性［1］，但也有較大毒性，且其毒性反應與劑量密切相關［2］。孫文等［3］運用HPLC-UV法測定栝樓的雄根、雌根、莖、葉、雄花、幼果、未成熟果實、成熟果實、未成熟果皮、成熟果皮、未成熟果瓤、成熟果瓤、種子、果柄等部位的葫蘆素B含量，結果發現不同部位中的含量均不等，數據出入很大。這提示我們為合理控制藥材安全性，栝樓不同藥用部位的葫蘆素B限量應分別制定。

馬雙成等［4］針對中藥中外源性有害物質殘留問題，對樣品普查進行歸納總結，認為目前影響中藥安全性的最重要的外源性污染物為個別藥材中的真菌毒素殘留，因我國水系和土壤的污染，也應高度關注中藥中重金屬殘留問題;還應將高毒、禁限用農藥及高檢出率農藥的農藥殘留量作為重點監控對象。瓜蔞具有較高的糖分，極易遭受蟲蛀和發霉，而且切絲加工后，若久置則種子的斷面氧化，導致顏色變黃，并產生黃曲霉毒素。但目前尚無文獻報道瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的真菌毒素污染情況。瓜蔞皮和天花粉中的重金屬殘留問題已有報道，主要為采用石墨爐原子吸收分光光度法進行測定，測定結果遠低于規定要求［5］。巢志茂［6］報道在瓜蔞栽培生產和加工貯存環節中，蟲害防治會用到磷銨、甲基異柳磷和氧化樂果等高毒農藥。林林等［7］建立了氣相色譜-質譜測定瓜蔞中70種農藥殘留方法和QuEChERS-SPEUHPLC-MS/MS測定瓜蔞中156種農藥殘留方法［8］，并測定了來自全國11個省份的84批瓜蔞樣品的農藥殘留量，同時結合瓜蔞種植基地的產地調研結果，對瓜蔞的農藥殘留情況進行分析和總結：瓜蔞的農藥殘留情況比較普遍，雖然大部分檢出值較低，但滴滴涕、對硫磷、三氯殺螨醇和特丁硫磷這5種禁限用農藥均存在含量超限問題［9］。王瑩［10］采用GCMS對天花粉中198個農藥指標進行了測定，結果只檢測出天花粉中含有PP'DDE，含量為0．014mg·kg-1。迄今，尚無瓜蔞子、瓜蔞皮和瓜蔞貯存中是否熏硫的研究報道，二氧化硫殘留量的檢測僅見于天花粉中，《中國藥典》2010年版第2增補本正式在天花粉藥材及其飲片品種項下增加二氧化硫殘留量檢查項目。此外，吳翠等［11］報道瓜蔞藥材有未成熟果實流入市場摻假的現象，由于未成熟果實干燥后外觀皺縮嚴重，當地不法商人將未成熟的種子和果瓤，混入膠和紅糖，裹以外地購買的瓜蔞皮，制成大小相當的瓜蔞，壓片切絲，造成市場銷售和流通的瓜蔞飲片質量嚴重下降。

由上可知，栝樓不同藥用部位自身的有毒有害成分及其他外源性污染物的研究較少，瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的安全性研究多見于農藥殘留的檢測，而且評價藥材安全性的指標未能與藥材從源頭到臨床的各個環節緊密聯系，無法有效確保藥材的安全性，現狀不容樂觀。

2 瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉有效組分的研究

瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的有效組分如多糖類、蛋白質和氨基酸類、黃酮及其苷類、皂苷類等均有文獻報道。但由于藥用部位不同，其所含的有效組分也不同。本文通過綜述各有效組分的化學成分、提取及分離純化方法和含量測定的研究以推動藥材及飲片更高水平的質量標準的制定工作。

2．1 多糖類 中藥多糖具有促進免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗應激、抗輻射及抗衰老等多種生物活性，且因其毒副作用小、無殘留、不產生耐藥性等優點而成為研究熱點。熊利芝等［12］通過實驗研究得出栝樓籽多糖對·OH自由基的清除能力強于檸檬酸和抗壞血酸，但其對·自由基的清除能力弱于抗壞血酸和檸檬酸。瓜蔞皮多糖的抗氧化活性研究結果表明其對·OH自由基和NO-均

2具有較強的消除作用，因此，瓜蔞皮多糖是一種天然的抗氧化劑［13］。多篇文獻報道天花粉多糖具有降血糖、抗腫瘤、增強免疫的作用［14～16］。鑒于瓜蔞多糖和天花粉多糖的多重生物活性，很多學者對該有效部位的提取及分離純化方法進行了研究。

多糖的提取工藝中常見的傳統的提取方法有水提醇沉法、堿提取法、酸提取法和索氏提取法。新型的提取技術有超聲波提取法、微波提取法、酶法、超臨界流體萃取技術和半仿生提取法。屠婕紅等［17］利用水提醇沉法提取瓜蔞皮中水溶性多糖，黃曉蘭等［18］比較了加熱回流、不同溫度浸提、超聲波振蕩提取天花粉多糖效果，最終確定采用 45℃超聲波振蕩的提取方法。微波提取法、超臨界CO2萃取法、纖維素酶法等新型提取工藝也應用于瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉多糖的提取。綜合文獻研究可得，微波提取法提取瓜蔞皮多糖得率最高，可達2．52%，比傳統提取法得率高2．7倍，纖維素酶法提取天花粉多糖得率最高，可達5．48%。

中藥多糖的純化方法有分步沉淀法、鹽析法、透析法、超濾法和柱層析法［16］。由于瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉化學成分復雜，純化多糖時往往先進行脫色、脫脂、脫蛋白等處理，再采用一種或幾種純化方法進行凈化。

中藥中多糖測定方法有比色法、滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層掃描法和高效毛細管電泳法等，以前3種方法最為常用。目前，測定瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的多糖含量時，均用葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法進行測定。但這種比色法因忽視了各藥材中多糖組成成分的復雜性而導致檢測結果偏離實際值。為此，很多學者對天花粉多糖、瓜蔞皮多糖的單糖組成進行分析，以確保檢測結果的準確性。黃曉蘭等［19］采用GC-MS、HPLC分析得出天花粉多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，這與屠婕紅等［20］通過薄層色譜法和氣相色譜法分析得出的天花粉多糖是一種由葡萄糖組成的均多糖的結論不一致。郝變等［21］采用高效液相色譜結合PMP衍生化法分析得出瓜蔞皮多糖由D-甘露糖、D-鼠李糖、半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、阿拉伯糖7種單糖組成。由此可見，不同分析方法對瓜蔞皮和天花粉多糖的單糖組成分析結果不同，這無疑會影響其含量測定結果。因此亟須進一步研究栝樓各藥用部位所含多糖的單糖組成，對以該有效部位評價瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的質量提供技術支撐。

2．2 蛋白質和氨基酸類 瓜蔞皮和天花粉中的蛋白質和氨基酸類研究報道較多，主要體現在γ-氨基丁酸、瓜氨酸的含量測定方面。瓜蔞皮的總氨基酸有良好的祛痰作用，瓜蔞皮氨基酸類成分中精氨酸含量相對較高，研究表明精氨酸具有抗高血壓、抗脂質過氧化等作用［22］。氨基酸類有效部位的提取方法為超聲提取法，提取溶劑有50%甲醇、50%乙醇以及鹽酸溶液等。常用的含量測定方法為雙波長薄層掃描法和柱前衍生高效液相色譜法。楊玉琴等［23］采用雙波長薄層色譜掃描法測得15個不同產地天花粉中瓜氨酸的含量，對展開劑優化后使各個斑點分開，以保證結果相對準確。而岳瑞等［24］則認為薄層掃描時2%茚三酮試液會引起顯色后測定誤差，故建議用1%的茚三酮試液進行顯色。郝變等［25］對異硫氰酸苯酯(PITC)和鄰苯二甲醛(OPA)兩種柱前衍生方法測定精氨酸的含量進行比較，結果發現OPA衍生法操作簡便，結果準確，可以用于瓜蔞皮中精氨酸的含量測定。為避免衍生物不穩定等問題，李愛峰等［26］以高效液相色譜-蒸發光光散射法測定瓜蔞中L-瓜氨酸的含量，方法學考察表明該方法適用于瓜蔞中L-瓜氨酸的含量測定。此外，韓琳娜等［27］利用氨基酸自動分析儀對10個山東栽培瓜蔞樣品中的水解氨基酸和游離氨基酸總量進行了含量測定。天花粉含有大量的氨基酸，其中γ-氨基丁酸和瓜氨酸是主要的具有生理調節作用的物質，陳阿虹等［28］采用快速液相色譜-串聯質譜法同時測定栝樓桂枝顆粒中γ-氨基丁酸和瓜氨酸的含量。

天花粉蛋白是從栝樓塊根中提取出的一種堿性蛋白，為單鏈核糖體失活蛋白。天花粉蛋白具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節等多種藥理活性。當前天花粉蛋白的分離方法有丙酮分級沉淀、離子交換層析、凝膠過濾法。但由于天花粉化學成分復雜，常常將多種純化方法結合起來分離純化天花粉蛋白。楊燁等［29］經硫酸銨分級沉淀結合Blue-SepharoseCL 6B和S-Sepharose兩步層析法獲得TCS純制劑。馬翠麗等［30］采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和分子篩層析純化新鮮栝樓根中的天花粉蛋白。汪苗苗等［31］對比分析了鹽析法和親和雙水相分離法，由凝膠電泳結果可知親和雙水相分離出的只有一條區帶，可認作為純品，而鹽析法僅使用于藥品純度要求不高的大批量生產。據報道，天花粉蛋白的含量測定方法有考馬斯亮藍紫外比色法和競爭ELISA方法。張波等［32］用考馬斯亮藍紫外比色法測定雌、雄株天花粉蛋白質含量，發現雄株含量高，建議雄株根入藥優于雌株。馮成強等［33］建立競爭ELISA方法檢測天花粉真偽品中的天花粉蛋白含量，結果發現偽品中均未檢出天花粉蛋白。這均為利用天花粉蛋白控制天花粉的內在質量提供了基礎。天花粉凝集素是一種糖蛋白，研究表明其具有明顯的降糖活性。僅有一篇文獻報道報道了天花粉凝集素的提取工藝：李瓊等［34］采用單因素及正交試驗對料液比、提取時間、提取緩沖液pH和NaCl濃度等提取因素進行優化，確定最佳提取工藝參數。2．3 黃酮及其苷類 中藥黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調節、抗衰老、鎮痛及保肝等，而且對心血管和消化系統有顯著的藥效。李愛峰［35］認為槲皮素-3-O-β-蕓香糖苷、木犀草素和芹菜素的擴張冠狀動脈、祛痰、止咳、抗動脈硬化、抗菌等生理活性與栝樓果皮潤肺化痰、利氣寬胸等功效基本一致。瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉中黃酮及其苷類有效部位的研究主要有提取工藝的優化、化學成分的分離鑒定等。提取工藝的優化主要包括提取方法、提取溶劑、溶劑用量、提取時間和提取溫度等。但即使采用最優工藝進行提取，總黃酮量得率仍比較低［36-37］。孫曉業等［38］采用柱層析和制備液相色譜分離純化95%乙醇提取物，可得到金圣草黃素、4'-羥基黃芩素。李愛峰等［35，39］對栝樓果皮進行化學成分分析，從乙酸乙酯部位分離出的黃酮類成分有槲皮素、木犀草素、芹菜素、香葉木素及其苷類。目前，瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉總黃酮的含量測定方法主要是紫外分光光度法，還沒有關于其單個黃酮及其苷類有效成分進行含量測定的研究，這與總黃酮得率低有關。

2．4 皂苷類 三萜皂苷具有抗癌、降血糖、降血脂、保肝、抗病毒等生物活性。陳穎等［40］報道栝樓中的皂苷主要為羊毛甾烷型的四環三萜和齊墩果烷型的五環三萜類化合物，同時還檢測天花粉總皂苷對DPPH自由基的清除能力，認為其具有體外抗氧化活性。李曉芳等［41］探討天花粉降血糖活性成分的分離和活性時，從80%乙醇洗脫組分得到一個可能為天花粉降血糖治療糖尿病的活性化合物，其基本骨架為四環三萜類。國外學者從天花粉的甲醇提取物中分離鑒定出8種葫蘆烷三萜類化合物并發現這8種葫蘆素類化合物對培養的人腫瘤細胞株均有顯著的毒性作用［42］。為提高總皂苷的提取率，盛桂華等［43-45］通過比較提取方法、提取溶劑(乙醇的體積分數)、溶劑用量、提取時間、提取溫度等優化總皂苷提取工藝。當前研究認為栝樓仁三醇是瓜蔞子的專屬性成分，可以作為其內在質量控制指標。劉金娜等［46］以瓜蔞子中3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量為考察指標，比較不同果實成熟度及加工方式對瓜蔞子質量的影響，以期為瓜蔞子的采收和加工提供科學依據。

2．5 脂肪酸類 栝樓籽油對羥基自由基能力和超氧陰離子自由基有較好的清除作用，說明其具有抗氧化作用。瓜蔞子脂肪酸類的提取方法、組分分析為經常報道的兩方面。常見的瓜蔞子脂肪酸的提取方法有索氏提取法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界CO2萃取法。通過設計正交試驗法或響應面法優化提取參數，得到最佳工藝。李福星等［47-48］分別采用氣相色譜法和氣相色譜質譜聯用技術分析瓜蔞子脂肪酸類的組成成分，得出亞油酸、亞麻酸是瓜蔞子不飽和脂肪酸的主要組成成分。脂肪酸類報道多為瓜蔞子中的脂肪酸類，瓜蔞皮、天花粉中相關報道較少。

通過綜述栝樓不同藥用部位的有效組分的化學成分、提取及分離純化方法和含量測定的研究發現：有效組分的藥理活性與瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的功效相關性不強，多糖類、天花粉蛋白有效部位的提取及分離純化方法和含量測定水平仍有待提高。因此，應繼續開展各藥材有效成分的研究，為飲片和相關制劑質量標準的完善提供技術支撐。

3 小結與討論

瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉的安全性研究既要重視內源性有毒有害物質的含量測定，又要加強外源性污染物的檢測。由于各藥用部位內源性有毒有害物質含量差異大，若執行同一個限量標準，勢必會制約到藥材及相關制劑的臨床應用，所以應分別制定各藥材的限量標準。外源性污染物的檢測不應僅局限于研究農藥殘留檢測，應與藥材采收、加工、貯存、流通各環節可能涉及的農藥殘留、重金屬殘留、二氧化硫殘留、有機污染物、摻假等實際情況緊密結合，在檢測時才能“有的放矢”，從而切實保證該類藥材、飲片和相關制劑的用藥安全。

瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉有效組分的化學研究與藥理研究不能相互對應導致至今仍沒有療效確切、結構確定的化學成分指標來控制其內在質量。在今后的研究中，應將各有效組分化學成分的分離鑒定、含量測定和與功效對應的生物活性有機結合起來，明確各藥材的藥效物質基礎，使化學成分的含量和藥材的質量相關，完善各藥材的質量評價體系。此外，在篩選控制藥材有效性的化學成分指標時，不僅要關注其藥理活性，還應考慮其在藥材中的含量，否則會嚴重降低所制定質量標準的可行性。

瓜蔞子、瓜蔞皮、瓜蔞和天花粉為多基原藥材，而當前的研究幾乎都集中于栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim．)。因此，應在栝樓的研究基礎上加強雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)各藥用部位的安全性及有效性研究，為各藥材更科學全面的質量標準的建立提供依據。