鐵皮石斛葉總黃酮泡騰顆粒劑的制備與抗氧化活性研究

林雪媛，王宇軒，彭意，劉桂燕，謝俊朗，鐘桂冬，羅惠玲，張澤蓉，王瑞彬，李艷萍

(1．佛山科學技術學院口腔醫(yī)學院＜醫(yī)藥工程學院＞，廣東 佛山528000;2．廣東順德工業(yè)設計研究院＜廣東順德創(chuàng)新設計研究院＞，廣東佛山528300)

鐵皮石斛是藥用石斛中的上品，具有強陰益精、厚腸胃、補內(nèi)絕不足、輕身延年等功效，自古有“藥中黃金”的美譽。鐵皮石斛曾是稀缺的野生藥材資源，現(xiàn)在通過生物技術已實現(xiàn)大規(guī)模種植。2018年5月，鐵皮石斛正式進入《藥食同源植物名錄》。同年6月，鐵皮石斛葉、花成為“新食品原料”。

鐵皮石斛的種植過程復雜，需要投入大量的人員、技術和資金［1］。《中國藥典》規(guī)定鐵皮石斛以莖部入藥，采摘時占鮮條產(chǎn)量約50%的葉子常被丟棄，造成藥材資源的嚴重浪費，也影響著產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益。因此，對鐵皮石斛葉進行有效開發(fā)利用具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛葉中黃酮含量豐富［2-3］，并且具有較好的抗氧化能力，若以黃酮碳苷含量及抗氧化活性為指標，鐵皮石斛葉和花代替莖入藥有一定可能［4］。黃酮類物質(zhì)是一種具有多種活性的天然成分，在抗心血管疾病和抗炎等方面有較多的應用。本論文將鐵皮石斛葉總黃酮提取物制備成泡騰顆粒劑，并測定其總黃酮的含量以及抗氧化能力。其中泡騰顆粒劑是一種以弱堿和有機酸為崩解劑的速釋劑型，投入水中會產(chǎn)生大量氣泡，迅速溶解后在水中均勻分布，具有吸收快、生物利用度高、便于運輸攜帶、口感好等特點［5］。

目前市場上鐵皮石斛的產(chǎn)品主要以莖部為主，其葉的產(chǎn)品很少，本論文的研究將為鐵皮石斛葉的開發(fā)利用提供一個參考方向。

1 材料與方法

1．1 儀器 DMF-4B手提式高速中藥粉碎機(浙江溫嶺市銘大藥材機械設備有限公司);JJ300型精密電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠);10目、18目與80目分樣篩(上海宜昌儀器紗篩廠);AS5150B型超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);UV1600PC型紫外-可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);YE3K165875移液槍(上海求精生化試劑儀器有限公司);RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1．2 試劑 鐵皮石斛葉(廣東國方醫(yī)藥有限公司);碳酸氫鈉(北京凌云建材化工有限公司);檸檬酸(廣州市海珠區(qū)化學試劑廠);藥用乳糖(上海華茂藥業(yè)有限公司);聚乙二醇6000(PEG6000，廣州市醫(yī)藥公司);乙醇(廣東光華科技股份有限公司);亞硝酸鈉(廣州試劑廠);DPPH(Sigma公司);Trolox(阿拉丁試劑公司);蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707);氫氧化鈉(廣州試劑廠);硝酸鋁(廣州試劑廠);石油醚(60～90℃，廣州試劑廠)。

1．3 方法

1．3．1 鐵皮石斛葉中總黃酮干粉的制備 將干燥至恒重的鐵皮石斛葉搗碎研磨成粉，用濾紙包好，置索氏提取器中，加入石油醚，在80℃水浴中回流脫脂。將脫脂后的粉末置蒸發(fā)皿中揮干石油醚，然后置250mL具塞錐形瓶中，加入80%的乙醇進行超聲提取，每次提取時間為50min，共提取3次并合并提取液。55℃下減壓旋蒸，得到鐵皮石斛葉總黃酮浸膏。將所得的浸膏冷凍干燥后即得干粉。

1．3．2 泡騰顆粒劑輔料處方的優(yōu)化 采取L9(34)正交試驗來優(yōu)化鐵皮石斛葉泡騰顆粒劑的處方，鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉質(zhì)量比恒定為6%。以粒度、溶化時間［9］為評價指標，考察乳糖的用量、檸檬酸與碳酸氫鈉的配比、PEG6000的用量對泡騰顆粒劑影響。正交試驗因素水平表見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

1．3．3 泡騰顆粒劑的制備 取乳糖、鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉分別粉碎，過80目篩，各分成2份，備用。

制備堿性顆粒：取PEG6000，加熱融化后，加入碳酸氫鈉，混勻，冷卻，粉碎后過80目篩，備用;取鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉于研缽中，按等量遞加法加入乳糖和PEG6000包裹的碳酸氫鈉混勻，加入適量70%乙醇混合制成軟材，過18目篩擠壓制粒，置60℃烘箱內(nèi)干燥(約1h)，過18目篩整粒，再過四號篩(65目)篩去細粉。

制備酸性顆粒：取鐵皮石斛葉總黃酮提取物干粉于研缽中，按等量遞加法加入乳糖和檸檬酸混勻，加入適量70%乙醇混合制成軟材，過18目篩擠壓制粒，置60℃烘箱內(nèi)干燥(約1h)，過18目篩整粒，再過四號篩(65目)篩去細粉。

表2 正交試驗設計及結果

將上述兩種顆粒混合均勻，即可。

1．3．4 泡騰顆粒劑的檢查 顆粒性狀檢查：取泡騰顆粒3份，每份10g，進行性狀檢查。

粒度的測定：取泡騰顆粒3份，每份10g，分別稱定重量，依次通過一號篩和五號篩，保持水平狀態(tài)過篩，左右往返，邊篩動邊拍打3min。取不能通過一號篩和能通過五號篩的顆粒及粉末，稱定重量，計算其所占比例(%)。

泡騰時間的測定：取泡騰顆粒3份，每份10g，分別移至盛有200mL水(溫度為25℃)的燒杯中，觀察并記錄泡騰時間。

休止角的測定：采取固定漏斗法［10］，將3只漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標紙上，漏斗下口距紙高度為H，小心地將顆粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗口中，直到錐體尖端觸到漏斗下口為止，測定錐體半徑R，計算休止角，重復3次。休止角的測定公式為：θ=arctan()，其中 θ為休止角，R為底盤半徑。

水分含量測定：取泡騰顆粒3份，每份5g，平鋪于干燥的稱量瓶中，厚度不超過10mm，精密稱定，開啟瓶蓋在鼓風干燥箱中100℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，放冷，稱重，稱至兩次稱重不超過5 mg，計算水分含量，重復3次。

1．3．5 泡騰顆粒劑中總黃酮的含量測定［11］標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁對照品0．0100g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成0．2mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液各0．00、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00mL，分別置于 10mL 容量瓶中，各加80%乙醇溶液補足5mL。分別精密加入5%亞硝酸鈉溶液0．3mL，搖勻，放置6min。加入10%硝酸鋁溶液0．3mL，搖勻，再放置6min。加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液4mL，最后用80%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。以第一瓶(0．00mL)作空白，用紫外-可見分光光度計在510nm處測其吸收度，作A-C標準曲線(同時計算其回歸方程)。

樣品含量測定：精密稱取泡騰顆粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，定容，得到供試品溶液。精密吸取3份供試品溶液各5mL，按上述標準曲線制備方法進行含量測定，并由標準曲線的回歸方程計算各樣品中黃酮的含量。

1．3．6 泡騰顆粒劑抗氧化能力的測定［1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH法)］［12-13］對照品 Trolox溶液IC50的測定：精密稱取 Trolox0．0010g，溶解后置于50mL容量瓶，定容，配制成80μmol·L-1的溶液，并將其稀釋成 60、40、20 和 10 μmol·L-1。取上述Trolox溶液各2mL，分別精密加入2mL的DPPH溶液，充分混合，室溫避光放置50min。用紫外-可見分光光度計測定在517nm處的吸光度，并計算清除率。同時，取2mL的80%乙醇與2mL的DPPH溶液混合后作為陰性對照，空白為80%乙醇。

樣品溶液IC50的測定：精密稱取泡騰顆粒3份，每份1．0g，溶解后置于25mL容量瓶中，用80%乙醇定容，然后將3份溶液分別依次稀釋成1、2、3、4、5mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液各2mL，分別精密加入2mL的DPPH溶液，按照對照品的測定方法進行實驗，并計算樣品溶液的清除率并作清除率-濃度曲線。

2 結果與分析

2．1 泡騰顆粒劑輔料處方優(yōu)化結果 正交試驗結果見表2，粒度方差分析見表3，溶化時間方差分析見表4。由表3可知，對于粒度因素A、B、C的影響均無顯著性。由表4可知，對于泡騰時間，因素A、C的影響較大，它們對應的極差也較大，為主要影響因素，B的影響較小。各因素主次順序為：A＞C＞B。結合表4中各因素極差分析，最終確定最佳輔料處方為A1B2C2，即乳糖含量為40%，檸檬酸與碳酸氫鈉的配比為 1．3∶1，PEG6000 含量為 9%。

依據(jù)此配方制備鐵皮石斛葉總黃酮進行泡騰顆粒劑(見“1．3．4”項下)并對其進行黃酮含量與抗氧化活性研究。

2．2 泡騰顆粒劑檢查結果 本實驗制備的泡騰顆粒劑顆粒均勻，大小一致，顏色淡黃，氣味芳香，不合格的顆粒比例平均值為1．88%(見表5)，從開始泡騰到溶化結束時間平均值為138s(見表6)，水分含量為5．45%(見表7)，結果均符合《中國藥典》2015年版(四部)的相關規(guī)定。另外，休止角平均值為29．70°(見表8)，說明其流動性好，可以滿足生產(chǎn)過程中流動性的要求。

表3 粒度方差分析表

表4 溶化時間方差分析表

表5 粒度檢查結果

表6 溶化性檢查結果

表7 水分測定結果

表8 休止角測定結果

2．3 泡騰顆粒劑中總黃酮含量測定結果 所得的標準曲線如圖 1所示，其方程為：Y=10．395X+0．0015(R2=0．9994)，表明在 0．0118 ～ 0．0590 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。根據(jù)此方程計算得到泡騰顆粒劑中總黃酮的含量平均值為(1．29±0．08)mg·g-1。

圖1 蘆丁對照品標準曲線圖

2．4 泡騰顆粒劑抗氧化能力測定結果 DPPH法是常用的抗氧化能力評價方法。陽性對照Trolox的清除率 -濃度曲線見圖 2，其 IC50為 22．54 μmol·L-1。泡騰顆粒劑的清除率-濃度曲線見圖3，其 IC50為(3．77±0．10)mg·mL-1。結果表明本實驗制備的鐵皮石斛葉總黃酮泡騰顆粒劑具有良好的抗氧化能力。

圖2 Trolox的清除率-濃度曲線

圖3 鐵皮石斛泡騰顆粒劑的清除率-濃度曲線

3 討論與結論

目前市面上鐵皮石斛葉的產(chǎn)品還較少，相關劑型還有待進一步開發(fā)。因此研究開發(fā)鐵皮石斛葉中的黃酮類化合物具有廣闊的前景。本文將葉中的黃酮提取物制備成具有良好抗氧化能力的泡騰顆粒劑，為鐵皮石斛葉資源的開發(fā)與利用提供了一個可行的方向。

中藥提取物一般容易吸濕，影響制劑的工藝。為減少泡騰顆粒吸濕，選用吸濕性較小的乳糖作為稀釋劑，同時采用等量遞加法將鐵皮石斛葉提取物干粉與乳糖等輔料混勻。這樣一方面降低了顆粒與主藥的吸濕性，另一方面使主藥分散均勻，保證制劑的均一性。另外，采用PEG6000包裹碳酸氫鈉，并把酸堿顆粒分開制粒，這樣可以有效地隔離了酸源與二氧化碳源，保證制劑的穩(wěn)定。

輔料的選擇與泡騰劑的處理對泡騰顆粒劑的制備也很重要。輔料要選水溶性強且吸水性弱的，否則泡騰時間會不達標且易在包裝袋中膨脹。PEG6000與碳酸氫鈉混合過程中，應先將PEG6000充分加熱溶解，然后稍冷片刻再加入研磨后的碳酸氫鈉粉末。否則碳酸氫鈉在高溫下易受熱分解，釋放出二氧化碳，會影響泡騰效果。