雙酶法水解尋氏肌蛤蛋白制備抗氧化肽的研究

孔美蘭 金榕 王佳虹

摘要：文章以尋氏肌蛤為原料制備抗氧化肽，研究木瓜蛋白酶—復(fù)合蛋白酶雙酶法酶解尋氏肌蛤的工藝條件。以1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除率為測定指標(biāo)，通過單因素和正交試驗確定雙酶法制備抗氧化肽的最佳條件。結(jié)果顯示：pH6.0，酶比例1∶1，[E]/[S]8%，酶解溫度60℃，酶解時間6.5h為最佳酶解條件。驗證試驗表明，在此條件下，抗氧化肽對DPPH自由基清除率為68.70%。

關(guān)鍵詞：尋氏肌蛤；抗氧化肽；雙酶水解；正交設(shè)計試驗

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）29-0106-03

尋氏肌蛤，俗稱薄殼，是潮汕地區(qū)一種常見的低值海洋貝類動物。尋氏肌蛤具有繁殖力強(qiáng)、生長速度快、產(chǎn)量高、分布廣等特點[1]。尋氏肌蛤含有豐富的蛋白質(zhì)、抗氧化肽、鈣等營養(yǎng)成分，營養(yǎng)元素豐富多樣，是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)海產(chǎn)品。尋氏肌蛤在每年夏季大量集中上市，大部分用于鮮食，少量經(jīng)過粗加工成為薄殼米出售[2]。收獲時期，由于鮮食量有限，造成尋氏肌蛤大量積壓，價格降低，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶增產(chǎn)不增收。

一、材料和方法

（一）材料和設(shè)備

尋氏肌蛤肉粉購于潮州市楓春市場，清洗、采肉，80℃熱風(fēng)干燥后，粉碎過80目篩成尋氏肌蛤肉粉，于-20℃冷凍保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）由美國Sigma公司提供，木瓜蛋白酶由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，復(fù)合蛋白酶由上海金穗生物科技有限公司提供，其余化學(xué)試劑均為分析純。PB-10酸度計，賽多利斯儀器有限公司；H1650高速臺式離心機(jī)，長沙湘儀儀器有限公司；UV-756分光光度計，上海光譜儀器廠。

（二）實驗方法

1.制備尋氏肌蛤抗氧化肽的工藝流程。尋氏肌蛤→處理蒸熟→脫殼，取肉→粉碎→80目過篩→加水制成懸浮液→調(diào)pH→按不同溫度、pH值、酶比例、加酶量和水解時間進(jìn)行酶解→95℃滅酶→冷卻，調(diào)pH→離心→上清液為抗氧化肽水解液→測定自由基清除率。

2.水解產(chǎn)物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的測定方法。稱取DPPH試劑250mg，用95%乙醇溶解，定容轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.025%的DPPH溶液。將DPPH溶液在室溫條件下靜置10min備用。在空白組中加入2mL樣品待測液與2mL95%乙醇溶液，室溫避光放置30min，在波長517nm處調(diào)零；在對照組中加入2mLDPPH溶液與2mLpH6.5、0.05M磷酸緩沖溶液，室溫避光放置30min，測定在波長517nm處吸光度（Ao）；在實驗組中加入樣品待測液2mL和2mLDPPH，搖勻，室溫避光放置30min，測定波長517nm處吸光度（Ai）。每個樣品重復(fù)3次，求得清除率的平均值[3]。

DPPH/%=■×100

3.單因素試驗。（1）[E]/[S]對酶解反應(yīng)的影響。[E]/[S]分別為2%、4%、6%、8%、10%，酶比例為1∶1，pH6.5，55℃水浴酶解3h，確定最佳酶與底物的質(zhì)量比。

（2）溫度對酶解反應(yīng)的影響。在[E]/[S]為4%，酶比例為1∶1，pH6.5，水解3h，溫度分別為55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，確定酶解反應(yīng)的最佳溫度。（3）時間對酶解反應(yīng)的影響。[E]/[S]為4%，酶比例為1∶1，酶解溫度55℃，pH6.5，分別酶解5h、5.5h、6.0h、6.5h、7h，確定最佳酶解時間。（4）pH對酶解反應(yīng)的影響。將反應(yīng)物pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，[E]/[S]為4%，酶解溫度55℃，酶比例為1∶1，水解3h后測定自由基的清除率。（5）酶比例對酶解反應(yīng)的影響。選定溫度為55℃，[E/S]為4%，pH值為6.5，反應(yīng)時間3h，調(diào)節(jié)木瓜酶與復(fù)合酶的比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、

1∶4，確定最佳酶比例。

4.正交試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過五因素、四水平正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化試驗條件，表1為試驗因素水平表。

二、結(jié)果與分析

（一）單因素試驗結(jié)果分析

1.酶用量對酶解反應(yīng)的影響。當(dāng)?shù)孜锍渥銜r，增加酶用量可提高底物與酶的有效接觸概率，進(jìn)而使DPPH自由基清除率增加，因此酶用量在2%—6%時，自由基清除率隨酶用量增大而升高；由圖1可知酶用量為6%時清除率達(dá)到最高，此時提取效果最佳；當(dāng)酶用量超過6%時自由基清除率下降，此時酶用量的增加促進(jìn)新生產(chǎn)的抗氧化肽進(jìn)一步降解，使得酶解產(chǎn)物抗氧化性下降。故最佳的酶用量是6%。

2.水解溫度對自由基清除率的影響。由圖2可知，在55℃—60℃范圍內(nèi)清除率與溫度成正相關(guān)，以60℃水解效果最佳。因為溫度會影響酶的活性，每種酶都有其最適溫度，當(dāng)溫度小于60℃時，溫度升高會靠近最適溫度，DPPH自由基清除率增大；60℃—75℃范圍內(nèi)，清除率呈降低趨勢，此時溫度高于組合酶最適溫度，酶蛋白變性甚至失活，酶解產(chǎn)物抗氧化肽含量減少，DPPH自由基清除率減小。故最佳的水解溫度是60℃。

3.水解時間對自由基清除率的影響。由圖3可知，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解時間的變化趨勢是先增大后減小。在5—6.5h隨著提取時間的延長，自由基清除率顯著升高，時間大于6.5h后，自由基清除率迅速下降，這是因為在反應(yīng)初期，抗氧化肽含量少，反應(yīng)速率快；隨著酶解時間的增加，原先產(chǎn)生的抗氧化肽被進(jìn)一步降解，使得抗氧化肽含量進(jìn)一步下降。故該實驗最佳水解時間為6.5h。

4.pH對抗氧化肽提取的影響。由圖4可知，自由基清除率隨著pH的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH6.5時清除率達(dá)到最高。這是因為木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶都屬于中性偏弱酸性酶，因此pH6.5時顯示最大活性。

5.酶比例對自由基清除率的影響。由圖5可知，自由基清除率隨著酶比例的改變呈現(xiàn)雙峰形變化趨勢，這可能是因為每種酶都有專一的酶切位點，兩種酶的專一性不同，能更多地切斷多肽鏈，因而可以提高水解度。從圖5可知，最佳酶比例為2∶1。

（二）正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果如表2所示。由表2可知，酶解溫度在尋氏肌蛤抗氧化肽提取中影響最大，其主次順序為A>C>D>B>E。根據(jù)正交試驗結(jié)果確定抗氧化肽最佳提取工藝條件組合為A2B2C3D3E3，即酶解溫度為60℃，pH6.0，酶用量為8%，提取時間6.5h，酶比例1∶1。

（三）驗證試驗

為了檢測正交試驗結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化條件A2B2C3D3E3進(jìn)行驗證試驗，測得自由基清除率平均值為68.7%，并且3次試驗清除率均高于正交試驗的16個工藝條件，故試驗結(jié)果可靠。木瓜蛋白酶與復(fù)合蛋白酶雙酶法提取尋氏肌蛤中抗氧化肽最佳工藝條件為：溫度60℃，pH6.0，酶用量8%，木瓜酶與復(fù)合酶比例1∶1，提取時間6.5h。在此條件下，DPPH自由基平均清除率達(dá)到68.7%。

三、結(jié)論

通過單因素和正交優(yōu)化試驗，確定了雙酶法水解尋氏肌蛤蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：酶解溫度為60℃，pH6.0，酶用量為8%，酶比例1∶1，提取時間6.5h，這時自由基清除率最高，達(dá)到了68.7%。本研究制得的尋氏肌蛤雙酶水解產(chǎn)物具有較好的DPPH自由基清除能力，具有一定的開發(fā)價值。本研究為提取尋氏肌蛤中天然抗氧化肽提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張正道.尋氏肌蛤的人工增殖[J].福建水產(chǎn)，1986，（2）：27.

[2]蔡英亞.尋氏肌蛤的養(yǎng)殖和利用[J].水產(chǎn)與教育，1975，（1）：9-11.

[3]田友昊.扇貝裙邊中抗氧化肽和牛磺酸的綜合提取工藝研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2015.