飼料微生物添加劑
——地衣芽孢桿菌檢驗方法驗證初探

■張 明 董 玲

（1.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.遼寧省農牧業機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種在土壤中常見的革蘭氏陽性嗜熱細菌，細胞形態和排列呈桿狀、單生，在惡劣的環境中以孢子形式存在[1-6]，研究表明地衣芽孢桿菌可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌[7]，達到調整菌群、治療目的[8-9]，因此被作為益生菌廣泛應用在醫療領域。近年來，地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑廣泛應用在飼料中，如卜祥斌等[10]與周振峰等[11]分別在肉雞與奶牛飼料中應用了地衣芽孢桿菌，獲得了較好的臨床效果。研究表明飼用地衣芽孢桿菌具有拮抗腸道病原細菌，維護和調節腸道微生態平衡的作用，增強動物機體的抗病力和免疫力，可有效的提高飼料的轉化率，增加畜禽產品的生產量，可作為抗生素的替代產品[12]。2013年地衣芽孢桿菌被列入到飼料添加劑菌種目錄中，是目前市售較集中的飼料中微生態制劑產品之一。

近年來，飼用地衣芽孢桿菌產品的市場占有率逐年上升，但仍處于起步階段，該類產品仍存在質量不穩定，缺乏完整的產品質量檢驗標準等問題[13]。因此，飼料產品質量監督檢驗機構開展飼料中地衣芽孢桿菌的質量檢驗已成為市場的迫切要求。

隨著分析技術的快速發展，行業標準的更新逐步加快，由原來的十幾年縮短到如今的一年或兩年，如飼料質量檢測方面，2017年一年就連續頒布幾十個新標準。標準更新越快就越需要檢測人員不斷提高專業水平，才能實現新技術新方法的準確應用。ISO17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》中要求實驗室對新技術、新方法進行驗證。目前，對于微生物檢測領域的方法驗證報道多集中在藥品的無菌檢驗和微生物限度檢查。本文對NY/T 1461—2007[14]《飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》進行驗證，文中詳細闡述了地衣芽孢桿菌檢測的要點、相關參數的考核以及各方面的注意事項，期望對飼料檢測機構開展新方法驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

質控菌株為地衣芽孢桿菌ATCC 6634，購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司。

1.2 產品來源

混合型飼料添加劑地衣芽胞桿菌由飼料添加劑生產企業提供。

1.3 儀器

生物安全柜CLASS Ⅱ（美國NUAIRE公司）；全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）；恒溫培養箱（德國BINDER 公司）；VITEK 細菌鑒定儀（BIOMERIEUX 公司）；AL 104-IC電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；顯微鏡（徠卡顯微系統上海貿易有限公司）。

1.4 培養基與材料

滅菌生理鹽水、桑塔斯瓊脂、革蘭氏染色套裝購自北京陸橋技術有限責任公司；營養瓊脂購自北京陸橋技術有限責任公司、青島海博有限公司、北京三藥有限公司；BCL鑒定卡購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司。

2 活菌數測定方法主要參數的確定

2.1 供試液的制備

稱取地衣芽孢桿菌樣品25.0 g，置于含225 ml 0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，添加20顆直徑4 mm的無菌玻璃珠，置振蕩器中，160 r/min振搖20 min，充分混勻制成1∶10 供試液。根據地衣芽孢桿菌樣品的理論活菌含量，為了實驗計數結果的準確性，使最終每塊平皿菌落數為30～300 CFU 每平皿，采取以下步驟稀釋：取1∶10 供試液1 ml，加稀釋液9 ml，制成1∶100供試液，之后按10倍梯度關系稀釋，每次稀釋時振搖60 s，稀釋至制成不同濃度稀釋液。

2.2 傾注法培養

選取3 個適宜的稀釋度，每個稀釋度做3 次重復。將1 ml供試液置于無菌培養皿中，使用融化的營養瓊脂培養基（50 ℃），向每個培養皿傾倒約12 ml營養瓊脂培養基，搖勻，待凝固后，于(36±1)℃倒置培養24 h，進行菌落計數。

2.3 培養溫度的考察

由于標準中未給出傾注法具體培養溫度，需要對培養的溫度進行考察。取地衣芽胞桿菌樣品按2.1節和2.2 節方法操作，同法制備3 組分別置30、36 ℃和40 ℃培養，于24 h分別觀察計數，計算不同培養溫度的活菌數。培養結果如圖1 所示，30 ℃培養時，菌落較小，不宜計數，且活菌數與其他溫度測定結果有顯著差異；36 ℃培養所得菌落大小適宜，容易計數，可作為參照溫度；40 ℃培養時，在16 h 菌落就已經過大，不適宜計數。因此，通過考察，推薦地衣芽孢桿菌在營養瓊脂上培養溫度為36 ℃，培養時間為24 h。

圖1 不同溫度下地衣芽孢桿菌的形態圖

2.4 培養基來源的考察

采用3個不同廠家的營養瓊脂實驗，取地衣芽胞桿菌樣品3 個按2.1 節和2.2 節方法操作進行活菌數測定比較。結果表明采用3 個廠家營養瓊脂實驗所得的結果之間無顯著性差異，表明上述3種培養基對于地衣芽孢桿菌的促生長能力相當。

3 活菌數測定方法的驗證

3.1 菌落特性檢驗

分別將樣品稀釋液劃線接種于營養瓊脂、桑塔斯瓊脂、牛肉浸汁培養基中于30 ℃培養48 h，觀察菌落特征。菌落特征分別為“杏仁白色、濕潤光澤”，“乳脂色、濕潤光澤、不透明”和“乳脂色、濕潤光澤、不透明”，符合NY/T 1461—2007規定的菌落特性。

表1 不同來源培養基對地衣芽孢桿菌生長的影響(CFU/g)

3.2 革蘭氏染色檢驗

使用革蘭氏染色套裝，按說明書進行染色，于生物顯微鏡（100倍油鏡）中觀察。革蘭氏染色結果為革蘭氏陽性。結果見圖2。

3.3 生化鑒定

使用BCL鑒定卡，對試驗樣品和標準菌株進行鑒定，鑒定結果為地衣芽孢桿菌，證明鑒定方法的準確性，具體結果見表2。

圖2 地衣芽孢桿菌革蘭氏染色結果

表2 地衣芽孢桿菌生化鑒定結果

3.4 重復性試驗

按NY/T 1461—2007 檢測方法對同一樣品進行多次測定，RD在0～21%，RSD為19.2%，結果見表3。

表3 重復性測定結果

3.5 中間精密度試驗

不同人員按NY/T 1461—2007 檢測方法對同一樣品進行測定，結果分別為3.2×1010CFU/g 和4.2×1010CFU/g，相對偏差為13.5%。

4 討論

微生物檢測方法確認首先應明確檢測對象特定的需求包括樣品的特征，數量，并應滿足客戶的特殊需要，同時應根據方法的預期用途，選擇需要確認的方法特性參數。通常應對方法的準確度、包容性和排他性等進行確認。本試驗的驗證對象為地衣芽孢桿菌，因此對該標準中的生化反應、菌落特征進行確認，明確地衣芽胞桿菌的生化特性和菌落形態，為活菌計數提供輔助測定，在活菌計數時必做項目為準確度和中間精密度實驗。

5 結論

方法驗證是實驗室開展新方法的前提和基礎，本實驗室在進行地衣芽孢桿菌檢驗方法的驗證中明確了NY/T 1461—2007 具體操作流程和注意事項。主要有以下幾個方面：

①地衣芽孢桿菌對酸性環境比較敏感，因此在配制培養基時應確保滅菌后培養基的pH 值為7 左右，以避免抑制地衣芽孢桿菌的生長；

②樣品的前處理包括稀釋對于準確測定活菌數至關重要，需考慮樣品處理方法、樣品振蕩時間、振蕩頻率，制備供試液時可添加適量的無菌玻璃珠；

③培養溫度是微生物檢測的關鍵因素，直接影響菌落的生長情況，進而影響到計數結果；

④防止芽孢桿菌污染的措施。芽孢桿菌中由于含有孢子，極易擴散，且難以除去，很容易對樣品和實驗環境造成污染，影響結果的準確性。