菜籽粕固體發酵及其理化性質的研究

■李莉娜 張林鑫 張凱凱 陳浩林 粟朝芝 吳 仙

(貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽550003)

菜籽粕是油菜籽提油之后的副產物，粗蛋白質含量約35%～45%，氨基酸組成相對均衡，且Ca、Mg等礦物質及維生素B、膽堿等維生素含量高，是一種具較高營養價值的植物蛋白資源[1]。然而因天然餅粕中含有多種抗營養因子，所以限制了菜籽粕在飼料工業的應用，相當一部分還被加工成有機肥料使用，大大浪費了菜籽粕營養價值的利用[2]。為了去除菜籽粕中硫甙、植酸、單寧等有毒物質和抗營養因子，提高其在動物飼料中的飼用價值，國內外學者進行了大量的研究。目前，在眾多處理方法中，固態發酵菜籽粕已成為研究熱點。很多研究報道表明微生物固態發酵可以改善菜籽粕的營養特性或飼用價值[3-6]。由于各原料的營養特性和實際應用的限制因素不同及發酵所選用的菌種或發酵方式不同，改善效果也存在不一致[7-8]。因此，本試驗以菜籽粕為底物，選用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、糞鏈球菌等菌種，通過單菌株與混菌株固體發酵試驗，研究菜籽粕發酵產品的理化性質。旨在通過菜籽粕的微生物固態發酵改善其營養價值，為其在動物飼料中的合理使用提供基礎參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菜籽粕、玉米粉和麥麩：菜籽粕購自貴州金瑞農業科技有限公司，麥麩和玉米粉購自貴州五斗米商貿有限公司，烘干，用高速超微粉碎機粉碎，過60 目篩保存備用。

無水氯化鈣：分子式CaCl2，分子量110.9，純度≥96.0%，成都金山化學試劑有限公司。

氯化銨：分子式NH4Cl，分子量53.49，純度≥99.5%，天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 菌種

查閱文獻選擇枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞鏈球菌發酵菜籽粕，分別在中國食品發酵工業研究院(中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC)和中國農業微生物菌種保藏中心(ACCC)購買，具體參數見表1。

表1 5種菌的基本信息

1.3 培養基

1.3.1 菌種活化培養基

①枯草芽孢桿菌活化培養基：麩皮50.0 g、豆餅粉30.0 g。上述成分混合后，加0.2%NaOH溶液1.0 L，煮沸1 h，用HCl中和到pH值7，然后加瓊脂20.0 g，熔化后，分裝滅菌。37 ℃培養1～2 d。

②植物乳桿菌活化培養基：酪胨10.0 g、牛肉粉8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂0.2 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 000 ml。pH 值6.2±0.2。37 ℃培養1～2 d。

③釀酒酵母活化培養基：5°Bé 麥芽汁瓊脂(青島海博生物技術有限公司HB4176-2)1.0 L，瓊脂15.0 g制備，自然pH值。28～30 ℃培養3 d。

④糞鏈球菌活化培養基：酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫801.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、7 水硫酸鎂0.02 g、1 水硫酸錳0.05 g、碳酸鈣20.0 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1.0 L。pH 值6.2±0.2。37 ℃培養1～2 d。

⑤黑曲霉活化培養基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g，pH 值自然。馬鈴薯提取液：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0 L。28～30 ℃培養5～7 d。

1.3.2 固體發酵培養基

在250 ml三角瓶中加入菜籽粕20 g、CaCl20.1%、NH4Cl 1.5%、玉米粉0.5%、麥麩0.5%、料水比1∶1.2攪拌均勻，121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 單菌固體發酵菜籽粕試驗

將枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、糞鏈球菌、黑曲霉打管復活，分別在液體培養基擴大培養，按30%接種量分別接種到固體發酵培養基中，攪拌均勻，密封放入30 ℃培養箱中連續恒溫培養3 d，設3個重復。發酵產品在35 ℃烘干，粉碎過60 目篩備用。測定有益菌活菌總數、真蛋白質量分數、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和單寧含量，同時測定原料真蛋白質量分數、硫苷含量、氨基酸和單寧含量。

1.4.2 混菌固體發酵菜籽粕試驗

根據單菌發酵試驗測定指標的結果，選擇真蛋白質量分數較高、硫苷含量最低和多肽得率最高的4個菌種，分別在液體培養基擴大培養，合理組合(雙菌、三菌、四菌)，分成10 個菌種組合，按1∶1，1∶1∶1，1∶1∶1∶1的比例、30%總接種量接種到固體發酵培養基中混合發酵，攪拌均勻，密封放入30 ℃培養箱中連續恒溫培養3 d，設3個重復。發酵產品在35 ℃下烘干，粉碎過60目篩備用。測定其有益菌活菌總數、真蛋白質量分數、硫苷含量、多肽得率、氨基酸和單寧含量。

1.5 檢測方法

有益菌活菌總數參照劉寶生等(2011)[9]枯草芽孢桿菌活菌數的測定方法；氨基酸含量參照NY/T 1582—2007 油菜籽中硫代葡萄糖苷的測定高效液相色譜法[10]；真蛋白質量分數參照王俊峰(2004)[11]飼料中真蛋白質含量的測定方法；硫苷含量參照汪正華(2000)的氯化鈀分光光度法[12]；單寧含量參照GB/T 27985—2011飼料中單寧的分光光度測定方法[13]；多肽得率參照魯偉(2005)蛋白水解液中多肽含量的測定方法[14]。

1.6 數據分析處理

利用SAS 9.1 軟件進行數據的差異顯著性檢驗，各指標以“平均數±標準差”表示。各組間差異顯著性用Duncan's 方法進行比較。指標差異顯著判斷標準為P＜0.05。

2 結果

2.1 原料理化分析結果

原料菜籽粕在干物質基礎上，粗蛋白為34.97%、粗脂肪為4.63%、灰分為7.23%、鈣為0.67%、磷為1.32%、真蛋白質量分數為31.81%、氨基酸含量271.17 mg/g、硫苷含量22.51 μmol/g、單寧的含量11.36 μg/g。

2.2 單菌株發酵產品理化分析結果

單菌株發酵菜籽粕結果見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6，發酵后有益活菌總數從大到小為：D＞A＞C＞E＞B，釀酒酵母比其他菌種發酵后有益活菌總數高，為3.85×107cfu/g(P＜0.05)達到差異顯著水平；各單菌株發酵后真蛋白質量分數為：A＞E＞D＞C＞B，枯草芽孢桿菌發酵真蛋白質量分數最高為39.51%，與原料相比提高了7.7 個百分點；發酵后氨基酸含量從大到小為：A＞C＞E＞D＞B，枯草芽孢桿菌發酵后氨基酸含量最高為296.41 mg/g，與原料相比提高了25.24 個百分點；發酵后多肽得率從大到小為：C＞D＞A＞E＞B，糞鏈球菌發酵后多肽得率最高為16.04%，與D 差異不顯著，但與A、B、E 之間差異顯著(P＜0.05)；發酵后硫苷含量從大到小為：B＞E＞C＞D＞A，其中枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有較高的硫苷降解能力，兩者之間差異不顯著，但與未發酵菜籽粕的硫苷含量相比，硫苷降解了10.68 個百分點；發酵后單寧含量從大到小為：B＞A＞C＞D＞E，黑曲霉發酵后最低為7.519 7 μg/g，與原料相比降低了3.84 個百分點。綜合上述結果，選擇降解硫苷能力強的A、有益活菌總數多的D、生產多肽最多的C 以及降解單寧強的E，進行雙菌、三菌、四菌混菌發酵試驗。

圖1 單菌株發酵有益活菌總數

圖2 單菌株發酵真蛋白質量分數

圖3 單菌株發酵總氨基酸含量

圖4 單菌株發酵多肽得率

圖5 單菌株發酵硫苷含量

圖6 單菌株發酵單寧含量

2.3 混菌株發酵產品理化分析結果

混菌株發酵菜籽粕見圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12，有益活菌總數中，B+C+D 組合最高為5.89×107cfu/g，其次C+D為5.50 cfu/g、A+B+C為5.22 cfu/g、A+B+D為4.54 cfu/g，四者之間差異不顯著，但與其他組合相比，達到差異顯著水平（P＜0.05）；真蛋白質量分數中，A+B 組合最高為45.79%，其次A+B+C+D 為45.69%，A+D 為45.68%，三個組合之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；氨基酸含量中，最高的組合是A+B+C+D為331.48 mg/g，其次B+C+D 組合為330.10 mg/g，兩者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；多肽得率最高的C+D組合為26.31%，其次B+D為24.78%，兩者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；硫苷含量中，降解能力最強的A+B+C+D 組合達到10.32 μmol/g，其次是B+C+D 為10.56 μmol/g、A+B+D 為11.21 μmol/g，三者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平（P＜0.05）；單寧含量中，降解最強的A+B+C+D組合達到5.61 μg/g，其次是A+B 為5.62 μg/g、B+C+D 為5.63 μg/g、A+B+D為5.69 μg/g，四者之間差異不顯著，但與其他組合相比，均達到差異顯著水平(P＜0.05)。

圖7 混菌株發酵有益活菌總數

圖8 混菌株發酵真蛋白質量分數

圖9 混菌株發酵氨基酸含量

圖10 混菌株發酵多肽得率

圖11 混菌株發酵硫苷含量

圖12 混菌株發酵單寧含量

3 討論

3.1 單菌發酵試驗對菜籽粕的影響

枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類一同發揮作用。本研究表明枯草芽孢桿菌發酵菜籽粕的效果顯著優于其他單菌，真蛋白質量分數提高了39.51%，總氨基酸含量提高了9.31%，可能是菌株利用氮源合成了菌體蛋白的原因。多肽得率為15.27%，硫苷為45.51%，這與何榮海等[15]用枯草芽孢桿菌固態發酵菜籽粕生產多肽及降解硫苷的研究結果接近，多肽得率15.94%，硫苷降解率可達62.14%。菜籽粕經過植物乳桿菌、黑曲霉處理后其抗營養因子均得到大幅度降解，其中黑曲霉的降解率高于植物乳桿菌，在改善菜籽粕營養品質方面植物乳桿菌效果優于黑曲霉。這與邱良偉等[16]的研究報道一致。

3.2 混菌發酵試驗對菜籽粕的影響

混菌發酵的原理是利用微生物種類多，數量大，繁殖快，易培養，酶系復雜等特點，采用發酵技術來去除菜籽粕中的抗營養因子[17]，不僅可以去除大部分抗營養因子，而且混菌發酵效果顯著優于單菌發酵效果[18]。本研究發現，B+C+D 組合有益活菌總數最高為5.89×107cfu/g；A+B組合的真蛋白質量分數最高為45.79%；A+B+C+D 組合的氨基酸含量最高為331.48 mg/g；C+D 組合的多肽得率最高為26.31%；A+B+C+D 組合降解硫苷能力最強達到10.32 μmol/g；A+B+C+D組合降解單寧最強的達到5.61 μg/g。與原料菜籽粕相比，真蛋白質量分數提高了13.98 個百分點，氨基酸含量提高了18.19%，硫苷含量降低了54.15%，單寧的含量降低了50.62%。這一結果與前人的研究不一致，張宗舟等[19]通過發酵法可使菜籽粕單寧分解率達到93.7%；孫林[20]采用植物乳酸菌、蠟樣芽孢桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌添加麩皮發酵菜籽粕48 h，菜籽粕單寧去除率達77.3%；胡永娜等[4]利用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和啤酒酵母三菌種組合發酵菜籽粕。菜籽粕硫苷93.44%、單寧降解率34.86%。可能是因為多菌發酵時多菌體系中微生物生長狀況良好，使發酵產物中的菌體數目增多。但是單寧含量沒有明顯降低，原因可能有兩個：一是因為試驗保證總接種量不變，每種菌的接種量相對減少，因此影響了發酵的總體效果；二是因為菌種之間可能存在拮抗作用。硫苷的降解效果明顯，主要是霉菌和酵母菌混合培養時，酵母能較快地利用基質中的可發酵性糖生長繁殖合成菌體蛋白，起到解除終產物阻遏作用，使霉菌能不斷分泌產生淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等，從而有效地分解碳水化合物，提高了硫苷的降解率。

4 結論

①單菌發酵中，枯草芽孢桿菌發酵效果顯著優于其他單菌，明顯提高了真蛋白質量分數和氨基酸含量，降低了抗營養因子含量。

②混菌發酵中，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞鏈球菌和黑曲霉的四菌組合發酵效果最好。