體外法估測日糧和飼料原料外源代謝葡萄糖值

■李 強 呂良康 熊 奕 張 慧 方 勇 馮 志 任 瑩 趙勝軍，2*

（1.武漢輕工大學動物科學與營養工程學院，湖北武漢430023；2.湖北省飼料工程技術研究中心，湖北武漢430023）

葡萄糖是唯一一種能通過血漿和細胞在全身循環的單糖，是生命活動所需能量的重要來源[1]。葡萄糖的吸收和利用在動物能量代謝中居于中心地位，如參與神經調節、機體活動等的各種代謝[2-3]。動物機體內葡萄糖主要包括兩種來源：外源葡萄糖和內源葡萄糖。外源葡萄糖指的是飼料內的可溶性糖和淀粉在消化道前段經過消化酶作用形成葡萄糖并由消化道吸收的部分[4]。而內源葡萄糖為腸前段未被消化吸收的營養物質由腸道微生物發酵分解，生成揮發性脂肪酸，通過腸壁擴散進入體內，由非糖物質（如乳酸、乙酸、丙酸等）在肝臟經糖異生作用轉化為葡萄糖的部分[5]。

根據前期研究基礎，方勇通過在豬回腸末端手術安裝“T”型瘺管，測定出日糧外源MG的含量[6]。了解到日糧中所含外源葡萄糖含量測定的關鍵在于確定淀粉在小腸內的消化率[7]。但運用體外法測定外源葡萄糖就無需復雜的手術或屠宰取樣，更具便捷性。同時還能完善體內法難以測定某單一飼料原料消化率的缺陷，可用于飼料營養價值的評定。

本研究通過與體內法測得的4種仔豬常用日糧的MG值相關性分析，擬確定最為合適條件的體外模擬消化法，隨之運用方法測定幾種常用仔豬飼料外源MG的含量，為建立以仔豬MG為營養基礎的飼料評定新體系和葡萄糖營養調控技術的可行實用化奠定基礎。

1 材料方法

1.1 試驗設計

對于體外酶促消化反應，溫度、pH值和消化時間之間幾乎無交互關系[8]，且Wilfart 等[9]研究顯示，豬采食后食糜平均1 h 到達十二指腸近端，從十二指腸近端到回腸遠端平均時間為4 h。因此為探尋最佳體外模擬消化條件，設計消化時間為單因素處理，分為1、2、4、6 h和8 h共5個處理，通過“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”對四種日糧進行體外模擬消化。并逐一將各個處理組的降解率與通過體內法測得的日糧淀粉消化率進行相關性分析對照，以兩者相關性最好的處理組時間作為體外法測定外源MG的最優時間。

根據已確定的最優體外模擬消化時間和其它試驗條件，測定六種常見飼料原料的MG值。

1.2 試驗日糧

六種常用飼料原料：玉米（新疆）、玉米（吉林）、二等小麥（荊門）、麥麩（周口）、豆粕（46%，江蘇）、豆粕（43%，武漢）。

4 種試驗日糧參照NRC（2012）飼養標準配制，同時按照千分之一比例添加TiO2作為外源指示劑，其中日糧Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ淀粉水平分別為25.81%、31.73%、45.71%、49.06%。其具體組成及營養水平見表1。

1.3 主要試劑、器材

胃蛋白酶（阿拉丁，P110928），胰蛋白酶（阿拉丁，P110505），100 ml三角瓶，恒溫搖床（上海知楚儀器有限公司，ZHSY-50）。

1.4 操作方法

1.4.1 消化液的配制

①擬胃液溶液：量取8.3 ml 濃鹽酸，同時稱取3.159 g NaCl 置1 000 ml 容量瓶中，加適量蒸餾水溶解稀釋置刻度，搖勻備用。

②2 mol/l NaOH溶液：稱取氫氧化鈉固體80 g，加適量蒸餾水稀釋，并轉移至1 000 ml容量瓶，定容備用。

③0.1 mol/l磷酸緩沖液：量取0.2 mol/l 磷酸二氫鉀溶液250 ml 至1 000 ml 容量瓶，后添加0.2 mol/l NaOH 溶液118 ml，加適量蒸餾水稀釋定容（含0.05%迭氮鈉）。

表1 日糧組成和營養水平

1.4.2 體外消化方法

本研究在已建立的體外消化試驗[8，10-15]基礎上，根據試驗目的和試驗條件做出適當調整，具體方法如下：

①模擬胃消化階段

粉碎已烘干飼料樣至過100目篩，稱取5 g（精確至0.000 1 g）于三角瓶中，分別加入胃蛋白酶500 mg，擬胃液溶液50 ml，以及0.5%氯霉素溶液[10]（細菌生長抑制劑）0.5 ml，后于恒溫搖床上消化1 h（40 ℃，120 r/min）。

②模擬小腸消化階段

模擬胃消化1 h 后，向三角瓶中繼續加入2 mol/l氫氧化鈉溶液2.5 ml，調節pH 值至中性，再加入磷酸緩沖液20 ml 和50 mg 胰蛋白酶，后于恒溫搖床中消化1、2、4、6 h和8 h（40 ℃，120 r/min）。

③消化殘渣的收集

待模擬小腸消化階段結束后，取出三角瓶，并用冰水多次沖洗瓶外壁，以使酶活反應降至最低甚至完全抑制。取得消化后的濾渣，用已知質量的紗布包裹濾渣放入烘箱（105 ℃，8 h），后稱重記錄。

1.5 測定指標和方法

根據雷龍等[16]（2017）的酶解法，來測定體外模擬消化所得殘渣的淀粉含量。

1.6 體外法淀粉降解率計算公式

P（%）=[(m1-m2)/m1]×100

式中：P——淀粉的體外降解率(%)；

m1——樣品中淀粉量(g)；

m2——消化后殘渣中淀粉量(g)。

1.7 數據分析

數據采用Excel 2016進行初步整理，用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析，采用“平均數±標準差”表示，單因素方差分析進行顯著性檢驗，采用Duncan's多重比較。

2 結果與分析

2.1 消化時間對日糧淀粉體外降解率的影響

表2 體外消化時間對日糧淀粉降解率的影響(%)

四種日糧淀粉體外降解率見表2，圖1?？梢钥闯?，在消化時間1 h 到6 h，四種日糧淀粉降解率都隨時間延長而呈顯著提高（P＜0.05），但在消化6 h 后漲幅變慢，表現為6 h 與8 h 的淀粉降解率無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 體外消化時間對日糧淀粉降解率的影響

2.2 體外淀粉降解與體內淀粉消化的相關性分析

根據方勇的體內法測得的淀粉消化率值，都高于本研究測得的日糧淀粉降解率[6]，將體外法各處理組值分別與其進行相關性分析對照，相關系數都大于0.900 0，其中體外消化6 h 的相關系數較高。如圖2所示，體外消化6 h的測定結果為自變量，以體內法測定結果為因變量，回歸方程為y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1），r=0.933 3。因此進行體外模擬消化測定淀粉消化率的最優時間確定為6 h。

2.3 六種常用飼料原料的淀粉體外降解率及外源MG值

將回歸方程（y=0.137 4x+84.834）與外源MG 的公式整合，即可得到體外法測定日糧外源MG的估算公式：

外源MG值（g/kg）=小腸淀粉量×（0.14×體外法測的小腸淀粉消化率+84.83）/0.9

式中：0.9為葡萄糖和淀粉的轉換系數。

運用上述方法和公式，評定了六種常用飼料原料，其結果如表3。

圖2 體外消化6 h測定淀粉降解率與體內法淀粉消化率的回歸關系

表3 六種常用飼料原料淀粉體外降解率及外源MG值

3 討論

外源MG 主要是指淀粉在腸道前段經一系列的作用后被小腸所吸收的葡萄糖，所以小腸的淀粉消化率是影響外源MG 的主要因素。體內法測定小腸淀粉消化率需要分別測定日糧和食糜中的脂肪含量[7，17-18]，則需進行動物屠宰試驗或者通過手術安裝“T”型瘺管，試驗過程復雜且不能夠測定某單一飼料原料的消化率。

在“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”的體外模擬消化法中，消化的時間長短可影響消化的速率以及消化程度。本研究中，在消化時間1 h 到6 h，四種日糧淀粉降解率都隨時間延長而呈顯著提高的趨勢（P＜0.05），6 h后的降解速率減緩，消化6 h與8 h的淀粉降解率無顯著差異（P＞0.05）。體外法測定的日糧淀粉降解率與體內模擬消化法測得的淀粉消化率相比較低，對兩者進行相關性檢驗分析，在體外模擬消化6 h 時與體內消化有較高的線性相關系數（r=0.933 3）。本試驗與現有的研究結果相同[19-21]。因此，體外模擬消化試驗的最佳時長為6 h。

“胃蛋白酶-胰蛋白酶兩段法”采用模擬動物消化道內的兩步酶解對淀粉進行消化的一種體外法，收集模擬消化后的剩余殘渣，測定淀粉含量，推算小腸淀粉消化率，本試驗方法具有高效、快捷、可重復等特點，甚至可以測定單一原料的消化率[6，22]。體外測定結果與體內試驗測定結果有相關性，對配方的制作有很大的參考價值。在體外消化6 h時與體內法相關性分析結果得到，兩者相關系數r=0.933 3，這與張鐵鷹等（2005）的報道一致[23]。建立本試驗方法后，本試驗測算了6種常用原料淀粉的體外降解率及其外源MG值，為今后各種原料MG 數據庫的建立奠定基礎，為實現豬日糧MG評價體系的建立提供可能。

4 小結

①體外模擬消化法測定淀粉消化率的最佳消化時長為6 h；

②體內法測得的淀粉消化率與體外模擬消化6 h 的淀粉降解率的線性回歸方程為：y=0.137 4x+84.834（R2=0.871 1）。由此推算出飼料外源MG 的體外法估算公式為：外源MG=（0.14×體外法測的小腸淀粉消化率+84.83）/0.9×小腸淀粉量;

③6 種豬料原料的外源MG 的含量為：玉米（吉林）667.41 g/kg、玉米（新疆）741.10 g/kg、麥麩（周口）396.40 g/kg、二等小麥（荊門）632.22 g/kg、豆粕（43%，武漢）84.11 g/kg、豆粕（46%，江蘇）93.25 g/kg。