探討新型隱球菌腦膜炎不同檢測方法的診斷價值

黃賽林，阮子強，向璇

(廣東三九腦科醫院，廣東 廣州 510000)

新型隱球菌腦膜炎（CNM）是由新型隱球菌感染腦膜和（或）腦實質所致[1]，屬于中樞神經系統亞急性或慢性炎癥性疾病。常見首發癥狀以頭痛、頭暈、嘔吐和發熱為主，由于其顱內感染時癥狀的不典型性及治療的不規范，誤診率及病死率仍較高[2]。近年來隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛或不適當應用，免疫缺陷性疾病及器官移植患者的增加，該病呈增長趨勢[3]。在流行病學上，新型隱球菌屬于一種機會性感染真菌，病原體多從呼吸道吸入，形成肺部病灶后經血液循環播散于腦膜。據文獻報道，隱球菌性腦膜炎發生率和死亡率在發達國家達到10%～30%，在發展中國家可達到50%～100%[3]。因此，臨床早期快速準確地診斷對于隱球菌腦膜炎的鑒別和診斷很有必要。目前墨汁染色對新型隱球菌的實驗診斷依然為一種有效的經典診斷方法，但需較多標本量離心處理后收集沉淀，制片墨汁負染后進行鏡檢，因而標本處理繁瑣、耗時，且結果判斷主觀性較大。真菌培養法為新型隱球菌檢測的基本方法，但敏感性低，耗時較長。上世紀80年開始乳膠凝集方法檢測血清和腦脊液中新型隱球菌莢膜多糖的定性或半定量的方法，但操作步驟繁瑣，結果判定主觀性也較大[4]。膠體金方法是繼乳膠凝集方法后建立的檢測新型隱球菌的方法，IMMY公司于2009年研發了膠體金方法試劑盒，其在常溫下性狀穩定，技術要求低，操作簡單，檢測時間短，結果易判讀。國內臨床檢測和流行病學研究多使用乳膠凝集方法進行檢測，而近年來采用膠體金方法進行檢測新型隱球菌感染診斷逐漸得到推廣[5]。為了客觀評價目前新型隱球菌檢測方法在臨床檢測中的應用價值，并探索降低假陽性的方法，本研究以墨汁染色、隱球菌培養、膠體金方法進行敏感度和特異性比較，并分析新型隱球菌診斷方法在腦膜炎鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 根據病史、臨床癥狀、體征、實驗室檢查和病原學檢查(墨汁涂片或培養陽性)以及抗生素和抗結核藥物治療無效，改用抗真菌藥物治療有效，確診為隱球菌性腦膜炎47例（其中21例經腦脊液真菌培養，39例經墨汁染色確診的隱球菌性腦膜炎，其余8例是病例跟蹤及后期臨床動態觀察確診）（診斷標準依據2010年中國真菌學雜志發表的《中國隱球菌診治專家共識》）。病例來自于2016年1月至2017年12月廣東三九腦科醫院神經科住院患者，其中男34例，女13例，年齡20～70歲。所有腦脊液標本均為第一次腰穿留取均在抗真菌藥物使用之前。對照組共60例（其中腦脊液常規生化正常非神經系統感染20例、經臨床確診為結核性腦膜炎的腦脊液20例、及化膿性腦膜炎為細菌感染且無真菌感染20例。

1.2 儀器和試劑 隱球菌抗原檢測試劑盒（膠體金免疫層析法）為美國IMMY有限公司產品；印度墨汁染液由貝索公司提供。隱球菌真菌肉湯為廣州市迪景微生物科技有限公司生產。

1.3 檢測方法

1.3.1 隱球菌抗原膠體金法 依據試劑產品說明書，試管中加入1滴樣本稀釋液，腦脊液經過離心（3000r/min）10min后取上清40μl加入試管， 插入試紙條，10min后讀取結果。出現一條質控線為陰性，質控線與檢測線同時出現為陽性，只出現檢測線而無質控線則檢測失敗。

1.3.2 隱球菌墨汁染色鏡檢 根據墨汁染色標準操作，墨汁染液選用印度墨汁，將3ml以上的腦脊液離心（3000r/min）10min，沉渣以 5：1 比例與墨汁混勻鏡檢，在黑色背景下可見到透亮的菌體和寬厚莢膜。

1.3.3 隱球菌培養和鑒定 依據第四版 《全國臨床檢驗操作規程》，培養腦脊液3～5ml接種到真菌肉湯，陽性標本接種沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)培養基35℃培養2～5d分純后進行菌種的鑒定。

1.4 統計學方法 運用SPSS 17.0軟件進行數據處理和統計學分析。

2 結果

2.1 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養試驗的靈敏度及特異性 47例最終被確診的隱球菌腦膜炎中，隱球菌膠體金法靈敏度100%，特異性98.33%；墨汁染色靈敏度65.95%，特異性98.33%；隱球菌培養靈敏度63.63%，特異性100%。

2.2 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養試驗在隱球菌組和對照組中的檢測結果 在隱球菌組中，隱球菌膠體金法陽性47例、墨汁染色陽性31例、隱球菌培養21例（其中共33例培養，陽性21例結果均為新型隱球菌）；對照組中除化膿性腦膜炎腦脊液中，隱球菌膠體金法陽性1例、墨汁染色陽性1例，隱球菌膠體金法、墨汁染色、隱球菌培養其余均無陽性結果。見表1。

表1 膠體金法、墨汁染色和培養試驗在各組中的檢測結果

3 討論

新型隱球菌腦膜炎的患者，典型表現為重度的頭痛；頭痛可持續數周至數月，伴有精神狀態、性格的改變，發熱，嗜睡和昏迷。多數資料顯示隱球菌感染和使用廣譜抗生素、激素、免疫抑制藥的廣泛或不適當有關，以及免疫缺陷性疾病及器官移植患者的幾率高[6]，但是我院首發癥狀按頭痛在神經內科就診患者病史中禽鳥類接觸者占多，特別是鴿子飼養者，隱球菌主要在鴿糞和被鴿糞污染的土壤中大量存在[7]，并無其他系統疾病引發，但是因為數據有限，無法進行流行學統計。臨床癥狀與結核性腦膜炎不易鑒別，易誤診為結核性腦膜炎，對于陰性腦脊液檢查結果，臨床又高度懷疑隱球菌顱內感染患者，不能輕易排除該病[8]。隱腦患者的腦脊液可呈典型的 “三高一低”腦膜炎表現，但無隱球菌性腦膜炎的特異性。診斷除了臨床表現外，目前臨床常用檢查方法主要包括腦脊液常規、生化等一般檢查、隱球菌莢膜多糖抗原檢測、腦脊液墨汁染色、真菌培養和影像學檢查等。墨汁染色是一種傳統的方法，可把隱球菌莢膜染成透明。印度墨汁染色的敏感性和特異性不一，常依賴于觀察者的經驗，在化膿性腦膜炎中有1例因莢膜抗原呈現假陽性，裂解的白細胞被誤認為真菌[9]。隱球菌培養和墨汁染色陽性是隱球菌性腦膜炎的確診依據，但真菌培養和鑒定的周期較長(3～7d)，且陽性率較低(55%～80%)[10]。 本研究結果顯示隱球菌腦膜炎患者初次腰穿，膠體金法較上述2種“金標準”法更為敏感，可達100%，適應于臨床排除診斷，對于初次腰穿腦脊液膠體金法陽性，而腦脊液涂片、腦脊液真菌培養陰性的中樞神經系統感染患者，應高度警惕隱球菌顱內感染的可能，需多次腰穿查找病原體。表1示對照組中1例臨床確診為化膿性腦膜炎患者，膠體金法陽性，多次腦脊液培養均未檢出隱球菌但是培養出細菌，提示膠體金法檢測新型隱球菌腦膜炎雖然有很好的敏感性，但也可能出現假陽性。膠體金檢測方法腦脊液與抗原可能交叉反應，易被誤診為新型隱球菌性腦膜炎，需結合其它檢測方法進行診斷，原因尚須進一步研究[11]。我們認為，隱球菌莢膜多糖抗原的膠體金免疫層析法最大價值是對新型隱球菌腦膜炎的早期診斷提供思路、線索和依據。依據三種方法各自局限性，聯合三種方法檢測值得臨床推廣。

隱球菌莢膜多糖抗原的檢測，根據現有文獻報道，具有高達90%以上的敏感度及特異度，已經作為隱球菌性腦膜炎確診的依據[12，13]。跟蹤病例發現，大部分患者莢膜抗原轉陰長達半年以上，部分患者長期治療后抗原卻一直存在體內。研究莢膜抗原檢測對疾病預后價值的評估以及抗原檢測轉陰或者滴度效價的變化后的停藥節點等問題[14]，還有待于進一步擴大臨床病例進行深入研究。