CYP2C19基因多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓的關聯研究

武子舉

(平頂山市第二人民醫院心內一科，河南 平頂山467000)

慢性心力衰竭是臨床中一種常見病，病因包括高血壓性心臟病、瓣膜病和冠心病等[1-4]。而左心衰是引起肺動脈高壓的常見病因[1]。相關研究顯示，近2/3的心力衰竭患者可能合并肺動脈高壓[2]。而心力衰竭患者一旦合并肺動脈高壓，其死亡風險會顯著增加[3，4]。因此，如何提高心力衰竭合并肺動脈高壓患者的診斷也就顯得尤為必要。CYP2C19基因編碼細胞色素P450超家族酶的成員[5]。細胞色素P450蛋白是單加氧酶，其催化許多涉及藥物代謝和膽固醇，類固醇和其他脂質合成的反應，這種蛋白質定位于內質[6]。之前有研究表明，CYP2C19等位基因功能缺失與不良的心血管事件明顯相關[7-9]。此次研究為了探究CYP2C19基因多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓患者的相關性，我們院于2014年6月至2016年6月期間收治了50例心力衰竭合并肺動脈高壓患者以及招募等數量健康人群，分析CYP2C19 rs12248560基因多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓患者的關聯，結果如下：

1 材料與方法

1．1 一般資料 我院于 2014年6月至 2016年6月期間收治了50例心力衰竭合并肺動脈高壓患者以及等數量健康人群的外周血樣本，其中心力衰竭合并肺動脈高壓病患者中有男性30例，女性20例，年齡范圍為14歲至43歲，平均年齡為（37．5±5．3）歲；正常人群組男性 32 例，女性 18 例，年齡范圍為 13 歲至 45 歲，平均年齡為（38．6±5．1）歲。納入標準：1）所有患者均經心臟彩超檢查，診斷為慢性心力衰竭合并肺動脈高壓；2）肺動脈高壓為輕、中度者；3）患者未接受鈣離子拮抗劑、前列環素類藥物的治療。排除標準：其他原因引起的肺動脈高壓，原發性肺動脈高壓，肺動脈高壓重度者，使用氯吡格雷以外的抗血小板藥，抗凝血劑或奧美拉唑作為質子泵抑制劑，血小板計數為低于150000/mm3，血細胞比容值＜33%或血清肌酐值＞2．5mg/dl。該研究通過本院倫理委員會批準，且招募患者及健康志愿者均在知情同意書簽字。兩組患者的一般臨床資料如性別、年齡、病程等無明顯差異（P＞0．05），結果具有可比性。

1．2 研究方法

1．2．1 DNA提取 在所有樣本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1．2．2 引物合成 CYP2C19基因上游和下游的引物合成序列見表1，引物由上海烈冰生物技術有限公司合成。

1．2．3 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增 預變性 95°C 4min、變性 95°C 30s、退火 56°C 30s， 延伸 72°C 30s，72°C 末延伸 5min；共35個循環；酶切體系及條件：10X FastDigest Gren Bufer 2μl，FastDigestenzyme 1μl(rs11615 使 用Eam1105I，rs13181 使用 AleI)，ddH2O 17μl，PCR 產物 10μl；水浴 37°C 酶切 10min，然后取出立即置水浴65°C滅活5min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45min，電壓設置為145V。

表1 基因引物設計

1．3 統計學分析 使用padgragh 6．0統計軟件進行分析。采用卡方檢驗分析Hardy-Weinberg遺傳平衡定律和兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異。檢驗水準α值取雙側0．05。

2 結果

2．1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 CYP2C19 rs12248560的CC、CT、TT基因型在對照組組數目分別為 34、12、4， 符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（χ2=0．12，P=0．94）。

2．2 CYP2C19 rs12248560基因型和等位基因頻率在心力衰竭合并肺動脈高壓患者組與健康對照組的分布 由表2結果表明，CYP2C19 rs12248560基因多態性均存在3種基因型，對各基因的3種基因型分布經卡方檢驗分析發現CYP2C19 rs12248560 的基因型分布有顯著差異（χ2=7．15，P=0．027）。 CYP2C19 rs12248560 的 C、T 等位基因在心力衰竭合并肺動脈高壓患者組的分布頻率分別為65%、35%；在正常對照組的分布頻率分別為76%、24%；兩組間差異具有統計學意義（χ2=5．36，P=0．024）。 見表 3。

表2 CYP2C19 rs12248560基因型頻率分布[n(%)]

表3 CYP2C19 rs12248560等位基因頻率分布[n(%)]

2．3 CYP2C19 rs12248560多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓發生的關系 分析CYP2C19 rs12248560基因的基因型與心力衰竭合并肺動脈高壓的關系時發現CYP2C19的T（突變型）等位基因與C（野生型）等位基因比較，差異具有統計學意義 （χ2=6．35，P=0．049）。見表 4。

表4 CYP2C19 rs12248560基因多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓的關系[n(%)]

2．4 PCR擴增 對CYP2C19 rs12248560位點的野生型、雜合突變型和純合突變型三種基因型和樣本進行PCR擴增，2%瓊脂變性凝膠電泳結果顯示，PCR擴增的DNA產物片段大小與預期相同，在91bp附近，每孔只有一條亮帶，條帶清洗無雜帶，PCR擴增特異性好。見圖1。

圖1 PCR產物電泳圖

3 討論

冠心病、高血壓和瓣膜病患者均可能會出現慢性心力衰竭，其中左心衰竭最為常見[10]。左心衰竭會造成肺動脈壓升高，不僅能引起左室收縮功能受損，而且能引起左室舒張功能受損；而左室舒張功能受損則引起右室收縮壓升高，進一步造成肺動脈壓升高[11]。此外，左室舒張功能受損還會引起心室肌主動舒緩延遲，減少肺靜脈流入左心房的血流量，從而加大左心房的代償性收縮，造成逆向進入肺靜脈的血流增加，進一步升高肺動脈壓。心力衰竭一旦合并肺動脈高壓，其死亡率會顯著升高[12]。為進一步提高對心力衰竭合并肺動脈高壓的診斷，對后續治療提供可靠依據，最近利用基因組學的精準治療的應用越來越廣泛。

之前有研究表明外周血管內皮功能障礙與CYP2C19變異體患者有關聯[13]。內皮功能在維持血管張力，血栓形成，血小板粘附和血管系統血細胞穩態中起重要作用，內皮功能受損反映早期動脈粥樣硬化改變[14]。動脈粥樣硬化改變引起慢性炎癥[15]，包括將血小板募集到內皮損傷部位，導致血小板活性的激活，最近報道內皮功能障礙與高血小板反應性獨立相關[16]。因此，內皮功能障礙可能對更高的血小板反應性具有累加效應，導致更多的載體中的心血管事件[17]。另外，已有研究報道奧美拉唑作為一種強效的CYP2C19抑制劑，經常用于肺動脈高壓患者的治療，已經顯示奧美拉唑的合用會增加經CYP2C19氧化代謝的藥物的血漿濃度[18]。

本次研究的結果顯示，CYP2C19 rs12248560基因型與等位基因頻率分布差異有統計學意義，并且CYP2C19 rs12248560 T/T基因型和T等位基因與心力衰竭合并肺動脈高壓顯著相關，說明了CYP2C19 rs12248560基因多態性在心力衰竭合并肺動脈高壓發生過程中是危險因素。本研究中雖然分析了CYP2C19的基因型、等位基因與心力衰竭合并肺動脈高壓發展的關系，但由于樣本量局限，在后續研究中需進一步擴大樣本數量。遺傳多態性在很多復雜性疾病研究中被認為發揮著重要作用。建立預測性生物標記物用于早期評估心力衰竭合并肺動脈高壓是非常有必要的，通過檢測基因多態性的預處理識別能夠指導臨床醫生開展合理的治療，對穩定患者病情非常有幫助。我們的研究提出了CYP2C19基因多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓發生的關聯，并指出了CYP2C19 rs12248560 T/T、等位基因T能夠作為心力衰竭合并肺動脈高壓發生的危險因素，可以作為早期預防心力衰竭合并肺動脈高壓的臨床標記物。

綜上所述，CYP2C19多態性與心力衰竭合并肺動脈高壓發生顯著相關，檢測其多態性對早期發現心力衰竭合并肺動脈高壓有一定價值。