基于熒光免疫技術檢測降鈣素原的方法建立和性能評估

章思思，張聞，周海濱，陳媛，周廣亮

(寧波瑞源生物科技有限公司，浙江 寧波330200)

降鈣素原（PCT）是一種無激素活性的糖蛋白，是降鈣素前肽物質，正常情況下由甲狀腺C細胞產生，含量極低。當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時，它在血漿中的水平升高[1-3]。自身免疫、過敏、局部有限的細菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會導致其升高或僅輕微升高。血中PCT的升高可能與細菌內毒素脂多糖、細胞因子誘導體內甲狀腺外組織產生大量PCT有關[4-6]。

PCT反映了全身炎癥反應的活躍程度．目前已成為臨床全身性細菌感染診治過程中必不可少的項目之一，從產生和消除的動力學過程來看，PCT也是最適合用作臨床診斷指標的，用于監測抗生素治療效果[7]。另外，PCT濃度變化對新生兒敗血癥、重癥肺炎、支氣管哮喘、術后感染等疾病的預警、鑒別診斷、病程監控和預后都有指導意義[8，9]。

現在市場上應用較多的PCT的檢測方法：酶聯免疫吸附法、化學發光法、膠體金試紙條法。然而，酶聯免疫吸附法所需檢測的時間較長；化學發光法的成本較高；膠體金法不能對檢測結果進行定量。因此，具有較強的特異性，而且操作簡便、測試時間短、重復性好的熒光免疫層析定量法是體外診斷行業中的發展趨勢。本研究基于熒光免疫定量測試技術，干化學層析法，建立一種快速定量檢測PCT的方法，對其性能進行了系統評價，并以降鈣素原檢測試劑盒 （VIDAS BRAHMS PCT酶聯熒光分析技術）做為參比試劑行了對比驗證。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 材料與樣本 收集2017年3月，寧波市第三醫院125例血清標本。收集2017年8月，江西省人民醫院同一病人的血清、血漿和全血樣本各50例。PCT抗原、鼠抗人PCT單克隆抗體（hytest）；PCT多克隆抗體(Hytest)；羊抗兔IgG抗體(武漢艾美捷)；兔 IgG(杭州隆基)；硝酸纖維素膜（NC 膜）、吸水紙(上海良信)；PVC 底板(上海捷寧)；熒光粒子(Life Technologies Corporation)；Tris-HCL、NHS、 酪蛋白 (sigma)；BSA(Moregate Bio Tech)；EDC(TCI)；Tween20(AMRESCO)；MES(羅氏診斷產品)；阻斷劑(杭州曼尼)；疊氮鈉(西安慶峰醫藥化工)．臺式高速冷凍型微量離心機(大龍興創實驗儀器)；超聲波細胞粉碎機 (寧波市先倡電子)；三維平面點膜噴金儀、微電腦自動斬切機、壓殼機(上海金標)；電子天平(梅特勒-托利多)。

1．2 制備方法

1．2．1 熒光微球抗體標記物的制備 取0．1ml的熒光粒子，清洗 3次(50mM MES清洗)后，加入 0．7mg的活化劑 EDC和0．7mgNHS，混勻，置于 37℃活化20min．離心，以質量比(熒光粒子：抗體)8．33：1 的最終濃度加入鼠抗人PCT單克隆抗體，置于4℃，交聯12h。 再加入0．066g的BSA，置于37℃封閉 1h。封閉結束后，10℃下，15000r/min，離心 30min，用1ml緩沖液保存(50mM MES)，即為降鈣素原熒光標記抗體．質控熒光標記抗體的制備方式僅改變抗體為羊抗兔IgG。

1．2．2 檢測緩沖液配置 粒子稀釋液：Tris-HCL pH8．5、0．75% 酪 蛋 白 、0．5%Tween20、0．9%NaCL、0．1%疊氮鈉．以降鈣素原熒光標記抗體終濃度1/200，質控熒光標記抗體終濃度1/1500，阻斷劑1/60的比例，其他以粒子稀釋液補充，配置檢測緩沖液。

1．2．3 檢測線及質控線的制備 取抗PCT多克隆抗體終濃度分別為 3．0mg/ml，噴量 1．0μl/cm，劃膜儀平臺移動速度100mm/s在硝酸纖維素膜上制備檢測線；取兔IgG終濃度為5mg/ml，用同樣方法制備質控線，室溫干燥．檢測線與質控線在NC膜上之間的距離約 4．0±0．1mm，線的寬度約 0．8～1．0mm；前后均勻；并置溫度 15～26℃；濕度≤30%；干燥24h以上。

1．2．4 組裝 在溫度15～30℃； 濕度≤25%條件下，將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板等物組裝，要求材料附著牢固，膜條切割應寬為4．0±0．1mm，然后裝入塑料殼。

1．3 評價方法

1．3．1 準確度評價(回收實驗)參照《體外診斷試劑分析性能評估(準確度-回收實驗)技術審查指導原則》[10]，以1/9的體積混合，制備待回收分析樣本和基礎樣本，對樣本進行5次重復測定，取其均值計算回收率，回收率（%）=（回收樣本-基礎樣本）/加入濃度X100。其回收率應在[85%，115%]，才滿足降鈣素原試劑盒的行業標準。

1．3．2 精密度評價 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP15-A3文件[11]，連續測定高、低值樣本20次，計算變異系數，以此作為批內精密度．每天檢測一批兩個濃度水平的樣本，每批重復2次，連測20d，通過統計計算日間精密度。

1．3．3 分析特異性(抗干擾)評價 取多份樣本，混成兩份不同濃度的混合樣本，在混合樣本中添加生理鹽水和不同濃度的干擾物，分別配制對照樣本和干擾樣本，干擾樣本配制成由生理至病理水平各種干擾物，各項目梯度值詳見2．3。每樣本重復測試5次，計算樣本和對照樣本的測值偏差。干擾物測值偏差＜20%視為無干擾。

1．3．4 線性范圍評價 用超過線性范圍高值濃度的抗原，按等比例稀釋至濃度0．1ng/ml以下，共5點(Xi)．對每一濃度的樣本各重復檢測5次，計算檢測結果平均值(Yi)，以(Xi)為自變量，(Yi)為因變量求出線性回歸方程，計算線性相關系數r，稀釋濃度(Xi)代入線性回歸方程，計算Yi的估計值及Yi與估計值的相對偏差或絕對偏差．降鈣素原檢測試劑盒行業標準要求線性相關系數|r|應不小于0．990。

1．3．5 檢測限 用0值抗原和低值抗原作為樣本進行檢測，重復測定10次．計算信號T/C平均值(x)和標準差(SD)，根據0值和低值濃度結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將x+3SD代入方程計算得出對應的濃度值即為最低檢測限．降鈣素原檢測試劑盒行業標準規定：生產企業應提供試劑盒的檢出限不高于 0．2ng/ml。

1．3．6 穩定性試驗結果 在試劑第6個月、第12個月、第18個月、第21個月時，分別做回收、批內CV、線性、檢測限試驗，分析試驗結果，根據試驗結果判定試劑盒的穩定性。

1．3．7 鉤狀效應試驗 本試劑考慮因標記或包被抗體量不足，抗原過剩導致的后帶效應．參考臨床可能達到的陽性高值，采用高濃度的降鈣素原純品進行梯度稀釋， 濃度分別為(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，每種濃度的抗原重復測試5次，以響應值(T/C)作為判斷依據。

1．3．8 臨床標本檢測結果 根據CLSI EP9-A3文件[12]，同時采用本試劑盒與VIDAS-PCT兩種試劑分別隨機檢測125例血清樣本．用檢測結果比較，計算兩種方法檢測結果的相關性和陰陽性符合率．來自同一個病人的血清、血漿和全血樣本各50例，比較同一病人3種不同樣本的檢測結果偏差。

1．3．9 統計學處理 使用SPSS 22．0軟件進行統計分析，檢測結果間的比較采用T檢驗進行分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

本試劑盒應用1株高特異性、高敏感性抗人PCT單克隆抗體和1株PCT多克隆抗體，以雙抗夾心法對樣本中的PCT進行檢測．檢測緩沖液與樣本在檢測管中混合，緩沖液中的熒光標記的PCT單克隆抗體Ⅰ與樣本中的PCT抗原結合形成抗原抗體復合物，當混合樣本被滴加到反應板的樣品孔，經由層析作用流向NC膜的另一端，被包被于膜上檢測區的PCT多克隆抗體Ⅱ所捕獲，同時檢測緩沖液中的熒光標記的羊抗兔IgG被包被與膜上質控區的兔IgG所捕獲．經由干式熒光免疫分析儀處理檢測區和質控區的熒光信號，計算轉換出樣本中PCT的濃度值。

2．1 回收實驗 根據計算，兩個分析樣本的回收率分別為110%和98%，平均回收率為104%，兩個樣本回收率與平均回收率的差值均小于±15%．回收實驗是評價試劑盒準確度的一種方法，回收實驗結果好，可以認為，試劑盒的準確度符合行業標準要求。見表1。

2．2 精密度實驗 選擇兩個水平濃度的樣本，分別進行批內和日間CV實驗。批內CV為4．38%和5．71%，小于 10%；日間 CV 為 5．49%和 6．56%，小于15%。見表2。

表1 回收實驗結果

2．3 分析特異性實驗 混合的兩份樣本濃度分別為0．5ng/ml和10ng/ml，在兩份樣本中加入不同濃度的干擾物，再測定PCT的濃度．加入不同量的血紅蛋白，使其終濃度為(g/l)：2、4、6、8、10，其他干擾判斷類似血紅蛋白．甘油三酯的濃度與血紅蛋白相同，游離膽紅素與結合膽紅素的干擾濃度分布(mg/ml)：4、8、12、16、20。 類風濕因子濃度為(IU/ml)：40、80、120、160、200。肝素鈉濃度為(IU/ml)：2．5、5、7．5、10、12．5。 乙二胺四乙酸鈉鹽濃度為(mg/ml)：0．3、0．6、0．9、1．2、1．5。 枸 櫞 酸 鈉 濃 度 為 (mg/ml)：0．76、1．52、2．28、3．04、3．8。 樣本中含以上濃度的干擾物，測得的結果均在±20%內，判斷上述干擾物對PCT檢測無影響。見表3。

2．4 線性實驗 采用高濃度抗原為原液，以4．89倍的比例依次稀釋下來，用理論濃度與PCT實測濃度作圖， 顯示 PCT 濃度在 0．05～53．21ng/ml內呈良好線性，斜率 K=0．9988，截距 B=0．0741，線性相關系數r=1．000，在行業標準要求范圍內．檢測平均值與估算值的相對偏差均＜±5%，絕對偏差均＜±0．5，說明檢測值有很好的梯度關系，即樣本梯度稀釋下來，所檢測的信號梯度很好，進一步說明線性相關性好。見圖1。

2．5 檢測限 分別對0值樣本和PCT低值樣本進行 10次檢測，得到回歸方程 Y=7．4492X-0．0246，將0值樣本x+3SD的結果代入回歸方程，計算得到檢出限為0．02ng/ml．檢出限結果在降鈣素檢測試劑盒行業標準范圍內。見表4。

表2 精密度評價結果

表3 不同干擾物對試劑的干擾實驗結果

圖1 PCT線性范圍驗證

表4 檢測限實驗結果

2．6 穩定性實驗結果 試劑盒放置6個月、12個月、18個月和21個月后，進行檢測，其檢測結果都滿足 1．3．1、1．3．2、1．3．4、1．3．5 的要求， 可以判斷試劑盒的有效期滿足18個月。見表5。

表5 穩定性試驗結果

2．7鉤狀效應試驗 用0值校準品稀釋高濃度的降鈣素原純品，得到待分析物濃度為(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，測試樣本的響應值。PCT 濃度從50ng/ml升到400ng/ml時，信號隨濃度增加而變大；而PCT 500ng/ml的信號反而低于400ng/ml濃度時的信號。由此可得：PCT濃度高達300ng/ml時未出現鉤狀效應。見表6。

2．8臨床樣本檢測結果 用本試劑盒和VIDASPCT兩種試劑同時對125例臨床標本進行定量分析，見圖2。對兩種試劑測得的結果進行T檢驗分析，兩者差異無統計學意義(P＞0．05，無顯著差異)，其相關性好，相關系數r=0．9951，直線回歸方程為Y=1．0111X+0．2498。 同時對 125 份樣本進行 Kappa一致性分析，Kappa 系數為 0．885＞0．75， 認為兩系統高度一致，等效，見表7。

表6 鉤狀效應實驗結果

圖2 臨床樣本相關性曲線

表7 Kappa一致性分析實驗結果

對于來自同一病人的血清、血漿和全血樣本各50份檢測后，進行相關性分析．血清與血漿對比線性方程為：Y=0．9879X-0．0455 r=0．9938； 血清與全血對比線性方程為：Y=1．044X-0．098 r=0．9875；血漿與全血對比線性方程為：Y=1．0589X-0．0607 r=0．995．可以看出，本試劑對血清、血漿和全血樣本的檢測，一致性良好，結果沒有明顯差異，說明試劑可同時用于以上3種樣本的檢測，方便臨床使用。

3 討論

PCT是一種由甲狀腺細胞合成的小蛋白，分子量13kDa由CALC-1 gene編碼，通過剪切pre-pro-calcitonin(141氨基酸單位的肽鏈)得到procalcitonin/pct．PCT是由116個氨基酸組成的肽鏈，包括N端氨基酸、活性降鈣素和降鈣蛋白三部分[13]．在 健 康 個 體 中 的 濃 度 非 常 低 ＜0．1ng/ml；PCT ＜0．25ng/ml不主張使用抗生素；＞0．25ng/ml主張使用；＞0．5ng/ml強烈主張使用[14，15]．因此可根據 PCT濃度作出是否存在細菌性感染的初步診斷，并選擇是否使用抗生素，以減少抗生素的泛濫、減輕病患的經濟負擔及降低細菌耐藥性的發生機率。

本試劑盒中的每個PCT檢測卡均有一個內部質控的過程以確保使用時日常質控的需求，該質控程序在每個病人樣本測試即同時執行．一旦檢測卡正確插入瑞易測干式熒光免疫分析儀中，儀器將完全識別．不正確的質控信息將會在瑞易測干式熒光免疫分析儀上顯示出錯誤信息，將需要進行重新測試．本研究結果顯示應用熒光免疫層析法檢測降鈣素原具有檢測限低、線性范圍廣、準確度和精密度高、分析特異性高、穩定性好、操作簡單等特點，能滿足大小醫院的檢測需求。