氣相色譜-質譜法測定食用植物油中3-氯-1,2-丙二醇酯的不確定度評定

熊麗，周鴻

(江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

氯丙醇酯是近年來國際上較為關注的新型食品污染物，以精煉植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯（3-MCPD酯）污染最為顯著，其含量是游離態氯丙醇（3-MCPD）的上百甚至上千倍[1]。近年來毒理研究表明3-MCPD酯具有一定的毒性作用[2]，但對其健康的擔心主要是因為氯丙醇酯會在加熱、加酸、微生物或人體腸道胰脂酶的作用下水解成游離態的氯丙醇[3]，而游離氯丙醇（3-MCPD）是公認的食品污染物，具有潛在的致癌性、神經毒性、免疫毒性、遺傳毒性和生殖毒性[4]，會對人體健康構成極大威脅。

不確定度是與測量結果相關聯的參數，表征合理地賦予被測量的分散性。為了保障實驗室提供的分析數據準確、可靠，及時分析與評定結果的不確定度具有十分重要的意義。本研究依據JJF 1059．1-2012《測量不確定度評定與表示》[5]，參照《2016年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》中《食品中脂肪酸氯丙醇酯含量的標準操作程序》及相關文獻[6-8]，采用氣相色譜-質譜法，對食用植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯測量結果的不確定度進行了評定，為進一步探討測量結果的準確程度和方法的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 7890B-7000C氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；XP-205電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；SK8200HP超聲清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；OSB-2100旋轉蒸發儀：日本ELELA公司；DHG-9101-3SA電熱恒溫箱：上海鴻都電子科技有限公司；氣密針（1．0ml）：瑞士hamilton公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯（3-MCPD 酯）、d5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯 （d5-3-MCPD酯）加拿大TRC公司。正己烷、甲醇、乙酸乙酯（色譜純）：德國Merk公司；甲基叔丁基醚（色譜純）：上海國藥沃凱；七氟丁酰基咪唑：日本TCI公司；乙醚（分析純）：國藥集團。硅藻土基質固相分散萃取柱、高效脫水劑：福州勤鵬生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 色譜條件 DB-5MS毛細管色譜柱 （30m×0．25mm×0．25μm）：美國 Agilent公司；進樣口溫度：280℃； 載氣： 高純氦氣 （純度≥99．999%）； 流速1．0ml/min；程序升溫：50℃保持 1min，再以 2℃/min的速度升至90℃，最后以40℃/min的速度升至280℃，保持5min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1．0μl。

1．2．2 質譜條件 電離方式為電子轟擊源 （EI）；電離能量 70ev；溶劑延遲 3min；阱溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；監測方式選擇離子掃描（SIM）；3-MCPD 衍生物定性離子 m/z為 253、289、453，其中253為定量離子；內標物d5-3-MCPD衍生物定性離子m/z為257、294、278，其中257為定量離子。

1．2．3 樣品前處理 準確稱取 0．1g（精確至 1mg）食用植物油于50ml離心管中，加入100μl（濃度為2．0μg/ml） 的內標使用液， 加入 0．5ml甲基叔丁基醚/乙酸乙酯溶液，混勻，超聲；水解：加入 1．0ml甲醇鈉溶液水解后加入冰乙酸中和以終止水解；凈化：用硅藻土小柱（基質分散固相萃取法）凈化，先以正己烷淋洗，再以無水乙醚洗脫，洗脫液充分脫水后轉移至雞心瓶中，減壓濃縮至近干，用滴管將其轉入帶磨口塞的5ml玻璃刻度試管中，再用正己烷分兩次充分洗滌雞心瓶內壁，合并洗滌液至約為 1．0ml；衍生：用氣密針加入 50μl七氟丁酰基咪唑 （HFBI）后于 75℃的電熱恒溫箱中衍生30min；衍生結束后，取出冷卻至室溫，補加正己烷至體積為1．0ml，再入2ml飽和氯化鈉溶液，充分渦旋，放置后取上層有機相以無水硫酸鈉脫水后供氣相色譜-質譜進樣分析。

1．2．4 標準曲線的制備 以0．10g飽和氯化鈉為本底，分別準確移取 10、50、100、200、300μl 3-MCPD酯標準使用液 （濃度為2．0μg/ml） 于50ml離心管中， 分別相當于 20、100、200、400、600ng的氯丙醇酯，以樣品為0．1g計算，相當于氯丙醇酯濃度分別為 0．200、1．00、2．00、4．00、6．00mg/kg （均以氯丙醇計），再各加入內標工作液（2．0μg/ml）100μl，混勻，之后步驟同1．2．3樣品前處理。

1．2．5 樣品檢測與計算 以3-MCPD衍生物的峰面積與內標衍生物的峰面積之比（Y）對3-MCPD酯的質量（X，ng）進行線性回歸，得到標準工作曲線，由標準工作曲線計算氯丙醇酯的質量，按下式計算食用植物油中3-MPCD酯的含量。

式中：X——試樣中氯丙醇酯含量 （均以游離態氯丙醇計），單位為mg/kg；

A——由標準曲線計算試樣中氯丙醇酯的質量，單位為ng；

m——食用油的取樣量，單位為g；

2 不確定度的來源

通過對實驗過程進行分析，不確定度的來源主要有重復性（隨機效應）、回收率（樣品前處理）、樣品稱量、內標加入量、標準溶液的配制以及標準曲線的擬合等引入的。不確定度因果圖見圖1。

圖1 不確定度因果圖

3 不確定度評定

3．1 測定的重復性（Rep）引入不確定度 對同一食用植物油樣品進行了6次平行測定，測定結果分別 為 0．775、0．688、0．781、0．702、0．788、0．825mg/kg，平均濃度0．760mg/kg，根據貝塞爾公式進行不確定度計算：

重復性的相對不確定度：Urel(rep)=×100%=×100%=2．87%

3．2 回收率（R）引入的不確定度

根據貝塞爾公式，

回收率相對不確定度：Urel(R)=×100%，Urel(R)=2．69%

用檢測統計數據t對平均回收率進行顯著性檢驗，在95%置信概率下，當t值大于或等于t的臨界值時，則回收率與1之間有顯著性差異，要引入修正因子，當t值小于t的臨界值時，回收率與1之間無顯著性差異，可以不做回收率校正。

在95%置信概率，自由度n=5時的t分布臨界值 t0．95(5)=2．57，本研究 t＜t0．95(5)，回收率和 1 之間無顯著性差異，可以不做回收率校正。見表1。

表1 回收率測定結果

3．3 樣品稱量（W）引入的不確定度 稱取0．1g樣品，據天平檢定證書其最大允許誤差為±0．05mg，按均勻分布處理（k=)，則稱重不確定度為：u(w)，u(w)0=0．029mg

該標準不確定度需計算兩次，一次為皮重，一次為總重，則稱量帶入的標準不確定度為：u(w)=，u(w)=0．041mg

稱量引入的相對不確定度：Urel(w)=×100%=0．041%

3．4 加入內標使用液帶入的不確定度（V） 用量程為 100μl移液器吸取 100μl內標使用液（2．0μg/ml），根據 JJG 646-2006《移液器檢定規程》[9]規定100μl可調移液器吸取100μl時容量最大允許誤差為±2．0%，按矩形分布，（k=)，

內標引入相對標準不確定對為：Urel(v)=×100%=1．15%

3．5 樣品溶液中3-MCPD酯測定濃度（c）帶入不確定度 樣品溶液中3-MCPD酯測定濃度（c）帶入不確定度由標準品的純度、標準溶液的配制以及標準曲線擬合三部分帶入。

3．5．1 標準品引入的不確定度 3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯標準品，純度為 98．0±0．5%，均勻分布，

標準品帶入相對標準不確定度為：Urel(c)0=×100%=0．30%

3．5．2 標準溶液配制帶入的不確定度 標準溶液配制帶入的不確定度由3-MCPD酯標準儲備液、中間液及使用液的配制三部分帶入。

3．5．2．1 標準儲備液配制帶入的不確定度 準確稱取3-MCPD酯標準品10mg于10．0ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，濃度1．0mg/ml。標準儲備液配制帶入不確定度包括三部分，天平稱量（m）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

天平稱量（m）：根據天平的檢定證書，稱量的最大允許誤差為±0．05mg，稱重有兩次稱量獲得（一次為皮重，一次為毛重），因每次都是獨立稱量結果，故計算兩次。u(m)0===0．029mg，u(m)==0．041mg

天平稱量引入的相對不確定度：Urel(m)=×100%=0．41%

容量瓶（v）：10ml容量瓶（根據 JJG 196-2006[10]，A 級允差±0．02ml），按矩形分布：u(v)=×100%=0．12%

溫度變化 （T）：由于溫度波動引起的體積變化，溫度波動范圍為 （20±5）℃，呈均勻分布，k=，乙酸乙酯的體積膨脹系數為 1．38×10-3℃-1，產生的體積變化 V=±（10×1．38×10-3×5）=±0．069ml，u(T)=×100%=0．40%

配制標準儲備液帶入的不確定度：Urel(c)1==0．59%

3．5．2．2 標準中間液配制帶入的不確定度 用單標線移液管吸取1．0ml標準儲備液于50．0ml容量瓶中，正己烷定容，濃度為20．0μg/ml。標準中間液配制帶入不確定度包括三部分，移液管（v0）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

50ml容量瓶 （根據JJG 196-2006，A級允差±0．05ml），u(v)=×100%=0．058%

溫度變化 （T）：正己烷的體積膨脹系數為1．36×10-3℃-1。

產生的體積變化 V=±（50×1．36×10-3×5）=±0．34ml，u(T)=×100%=0．39%。

1．0ml單標線移液管（根據 JJG 196-2006，A 級允差±0．007ml），u(v)0=×100%=0．40%。

配制標準中間液帶入的不確定度為：Urel(c)2==0．59%。

3．5．2．3 標準使用液配制帶入的不確定度 用單標線移液管吸取1．0ml標準中間液于10．0ml容量瓶中，正己烷定容，濃度為 2．0μg/ml。3-MCPD 酯標準使用液配制帶入不確定度包括：移液管（v0）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

10ml容量瓶 （根據JJG 196-2006，A級允差±0．02ml），u(v)=×100%=0．12%；

溫度變化 （T）：正己烷的體積膨脹系數為1．36×10-3℃-1，

產生的體積變化 V=±（10×1．36×10-3×5）=±0．068ml，u(T)=×100%=0．39%；

1．0ml單標線移液管（根據 JJG 196-2006，A 級允差±0．007ml），u(v0)=×100%=0．40%

配制3-氯丙醇酯標準使用液帶入的不確定度為：Urel(c)3==0．57%

3．5．2．4 標準曲線擬合帶入的不確定度 對標準系列每個濃度點進行三次測定，由最小二乘法原理進行擬合求得標準曲線，Y=0．0065x-0．0017，r2=0．9997，樣品測定 6 次響應值：0．505、0．478、0．518、0．490、0．521、0．559， 帶 入 方 程 求 得 濃 度 （ng） 為78．0、78．4、79．9、75．6、80．5、86．3，由此求得 cc=79．0

標準曲線標準差：SA=SA=0．036，c=（20+100+200+400+600）/5=264式中，sA—標準

曲線的標準差；p—樣品溶液的測定次數 （p=6）；n—標準溶液的測定總次數 （n=15）；b—標準曲線的斜率；a—標準曲線的截距；cc—由標準曲線求得的樣品溶液中濃度；c—各標準溶液中濃度的平均值；ci—由標準曲線方程得出的標準溶液中濃度的測定值。見表2。

表2 標準曲線擬合帶入的不確定度的參數

標準曲線擬合帶來的相對不確定度：Urel(c)4=×100%=4．35%

3．5．2．5 樣品溶液（c）帶入總的相對標準不確定度為Urel(c)=4．47%

3．6 合成相對不確定度和擴展不確定度

3．6．1 合成不確定度

Urel(X)==6．1%

3．6．2 擴展不確定度 按國際慣例，95%置信概率下取包含因子k=2，測量結果的相對擴展不確定度為：U=Urel(X)×k×X，U=6．1%×2×0．760=0．09mg/Kg

3．7 不確定度報告：X=（0．76±0．09）mg/Kg （k=2，p=95%）

3．8 不確定度各分量結果 見表3。

表3 各分量的不確定度

4 討論

本次評定將樣品處理過程中的水解、凈化、衍生等操作帶來的不確定度，通過計算回收率的不確定度來表示。

根據內標法的定量原理，本次評定并沒有計算內標純度以及配制所帶來的不確定度，因為只要在實驗中對樣品及標準系列加入同一內標標準使用液，那么內標溶液的濃度對待測組分的定量將沒有影響，因此只需分析內標的加入體積所帶來的不確定度。

本文建立了GC-MS法測定食用植物油中3-氯丙醇酯的不確定度評定方法，定量計算出測量結果的可信程度，評估了合成不確定度和擴展不確定度，對檢測結果的符合性判定和后續的試驗優化工作具有重要意義，通過比較各分量的相對不確定度大小可以看出，標準曲線擬合是不確定度最主要的來源，其次是重復性與回收率，稱取樣品所帶來的不確定度可以忽略不計。