HSP70-2基因多態性與急性胰腺炎的相關性分析

楊彩芳，閆樂，梁浩衛

(1．新密市中醫院消化內科，河南 新密452370；2．河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

流行病學研究顯示，急性胰腺炎的發病率可達（334～566）/10000 人[1]，特別是在具有暴飲暴食或過度飲酒的人群中，急性胰腺炎的發病率可持續性上升。不同的因素均可以促進急性胰腺炎的發生，包括膽道因素、飲食習慣或感染等均可以增加急性胰腺炎的發病風險。炎癥因子的表達變化可能通過影響胰腺導管上皮細胞膜完整性，提高胰腺內分泌酶的持續性異常外分泌的風險，導致胰腺間質成分的分解代謝，促進胰腺炎的發生發展[2，3]。 熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是重要的炎癥因子，能夠促進胰腺腺體細胞的損傷，促進導管管壁的狹窄，增加胰腺內分泌酶釋放入胰腺間質成分的風險，導致自身性消化過程的發生[4]。HSP基因多態性的改變，能夠通過影響炎癥反應過程，加劇胰酶分泌障礙，影響導管上皮的狹窄程度等，參與急性胰腺炎的發病過程中。本研究選取2016年3月至2017年7月在河南省新密市中醫院治療的急性胰腺炎患者91例，探討了相關指標的表達及其與患者病情嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2016年3月至2017年7月在河南省新密市中醫院治療的急性胰腺炎患者91例，其中輕型胰腺炎患者47例（輕型組），重型胰腺炎44例（重型組），采用性別、年齡配對選取健康志愿者100例作為對照組，各組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0．05），見表 1。 納入標準：①診斷符合中華醫學會消化病學分會胰腺疾病學組制定的標準[3]；②發病至入院時間＜72h；③患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：①合并有高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等慢性基礎性疾病；②妊娠期或哺乳期婦女。

1．2 檢測方法 基因多態性檢測：采集患者的外周血，采用EDYTA抗凝，采用經典的苯酚-氯仿法提取DNA，加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達 20μl，上機，反應條件為：93℃ 2min、93℃ 1min、55℃ 2min， 共 40 個循環。

PCR產物擴增后進行基因多態性檢測：參考multiplexkit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明，加入各位點對應延伸引物進行單堿基測序反應。并在ABI1310（Life Technologies，美國）進行電泳，結果用GENEMAPPER軟件（Life Technologies，美國）進行分析。

1．3 觀察指標 觀察兩組HSP70-2基因型和等位基因分布，同時比較不同預后患者性別、年齡、淀粉酶、C 反應蛋白（C reactive protein，CRP）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、CT 嚴重程度指數（CT severity index，CTSI）評分、急性生理與慢性健康評分Ⅱ（Acute physiological and chronic health score II，APACHEⅡ）。

1．4 統計學處理 統計分析采用SPSS 19．0軟件，計量資料采用（x±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗；計數資料比較使用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析；兩組基因型情況采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 HSP70-2基因多態性結果 HSP70-2基因PCR產物經PstⅠ酶切后凝膠電泳顯示GG型（1139bp+936bp）、GA 型 （2075bp+1139bp+936bp）和 AA 型（2075bp）。

2．2 各組HSP70-2基因多態性比較 經Hardy-Weinberg平衡檢驗，輕型組、重型組和對照組受試者HSP70-2基因型分布符合遺傳Hardy-Weinberg平衡。輕型組、重型組和對照組HSP70-2基因型和等位基因分布差異有統計學意義（P＜0．05），重型組基因型GG和等位基因G比例明顯高于輕型組和對照組（P＜0．05）；輕型組基因型 GG 和等位基因 G比例明顯高于對照組（P＜0．05），見表 2。

表2 各組HSP70-2基因型和等位基因分布[n（%）]

2．3 不同預后患者各指標比較 91例急性胰腺炎患者中，最終死亡16例（死亡組），存活75例（存活組）；死亡組和存活組性別、年齡和淀粉酶水平比較差異無統計學意義 （P＞0．05）； 死亡組 CRP、TC、TG、CTSI評分、APACHEⅡ評分和基因型 GG比例明顯高于存活組（P＜0．05），見表 3。

2．4 多因素分析 將上述指標作為自變量，是否死亡作為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示CTSI評分、APACHEⅡ評分和HSP70-2基因型GG是急性胰腺炎患者死亡的影響因素 （OR=2．252、2．188 和 1．324，P＜0．05），見表 4。

3 討論

急性胰腺炎的發生，能夠導致患者多器官功能衰竭的發生，增加不良臨床結局的發生風險。長期的臨床隨訪研究顯示，急性胰腺炎導致的患者多器官功能衰竭、彌散性血管內凝血、心腦血管疾病或肝腎功能衰竭的發生風險可顯著上升[8]。一項包含了331例樣本量的胰腺炎的發病結局的分析研究顯示，臨床上急性胰腺炎導致的急性肝功能衰竭的發生率可達15%以上，而病死率也可達5%以上[5]。臨床上缺乏對于急性胰腺炎的早期診斷及臨床預后評估指標，而本次研究通過對于炎癥因子的多態性的研究，能夠為臨床上急性胰腺炎患者的臨床預后評估提供重要的參考，并可以為揭示急性胰腺炎的發病機制提供一定的理論依據。

表3 死亡組和存活組各指標比較

表4 多因素分析

炎癥因子的改變，不僅能夠參與感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病的發生過程中，同時炎癥因子的表達水平變化還能夠通過誘導腺體細胞的內分泌功能的改變，加劇局部內分泌腺體組織的氧化應激損傷，促進組織間質成分的水腫，導致消化酶的排出困難[6，7]。炎癥因子多態性的改變，能夠影響炎癥因子的生物學活性，導致胰腺間質成分的滲出性病變、出血、機化及組織間質成分的代償性增生等病理過程，影響胰腺炎的發病過程[8，9]。HSP70-2基因多態性包括45kb的DNA序列，上游包含12個外顯子及8個內含子。HSP多態性的改變，還能夠影響下游白細胞介素（IL）-6或者IL-10等生物學因子的變化，促進單核細胞或中性粒細胞等對于胰腺組織的浸潤，提高消化酶對于自身組織的侵蝕程度[10，11]。作為HSP多態性的重要成分，HSP70-2基因多態性已經被證實參與惡性腫瘤的發生過程，但在急性胰腺炎的發病過程中作用機制的分析研究不足。

在不同病情的急性胰腺炎患者中，基因型GG和等位基因G的表達具有顯著的差異，其中患者的病情越重，其基因型GG和等位基因G的表達比例越高，提示HSP基因多態性可能顯著影響了急性胰腺炎的發病過程，同時其能夠影響患者的病情進展速度，導致多器官功能衰竭的發生，從機制上考慮，HSP70-2多態性中基因型GG和等位基因G的差異對于患者病情的影響，可能與下列幾個方面的因素有關[12，13]：①HSP70-2基因的GG或G等位基因的表達差異，能夠導致患者HSP上游轉錄基因活性的改變，導致HSP的炎癥浸潤的加劇，促進患者肝腎上皮組織細胞的炎癥損傷，影響患者的臨床治療預后；②HSP70-2基因區域G等位基因多態性的改變，能夠影響細胞膜上鈣離子通道的開放，進而進一步加劇胰腺組織的缺血/再灌注損傷，導致胰腺導管的痙攣及狹窄。付林堯等[14]在探討了83例樣本量的急性胰腺炎患者的臨床結局后發現，HSP高表達的患者中，胰腺炎治療后的病死率可達4%以上，同時HSP多態性中等位基因型的差異，能夠顯著影響患者的胰腺消化酶的釋放速度，增加導管阻力，提高消化酶突破導管后浸潤胰腺間質成分的風險，這與本次研究的結論較為一致。在病死組胰腺炎患者中，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇（total cholesterol，TC）、胰腺炎嚴重程度床邊指數評分標準（CTSI)等指標顯著上升，表明血脂代謝紊亂或胰腺炎相關危重癥評分體系是影響急性胰腺炎患者臨床預后的重要指標，而多態性的分析也可以發現，基因型GG比例顯著上升，表明基因型的改變能夠影響患者的臨床預后，其原因主要考慮與HSP多態性的改變對于患者病情進展過程中胰腺組織中消化酶的分泌速度、急性腎功能衰竭的發生等的影響有關。最后，相關分析也可以發現，CTSI評分、APACHEⅡ評分和HSP70-2基因型GG是急性胰腺炎患者死亡的影響因素，進一步提示了HSP70-2基因多態性對于患者臨床預后的影響[15]，這主要由于CTSI評分、APACHEⅡ評分能夠反應患者的病情嚴重程度，評估胰腺組織病理性損害的程度；而HSP70-2基因多態性對于患者臨床預后的影響，這主要考慮與HSP70-2基因多態性影響到胰腺組織的自身損傷、促進瀑布式炎癥反應的激活等因素有關。

綜上所述，HSP70-2基因型GG或者G等位基因的表達變化，能夠影響急性胰腺炎的病情進展，并與患者的臨床預后密切相關。