GC-MS測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定

宋迎春，袁婭，王艷敏，周鴻

(江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌330029)

五氯酚（PCP）是一種有機氯農藥，常見的形式為五氯酚及其鈉鹽，主要作為殺蟲劑、滅菌劑、除草劑及木材防腐劑使用，我國很多區域環境介質中均檢出有五氯酚鈉殘留[1-3]。五氯酚可通過吸入、食入和經皮吸收等途徑進入體內，并在體內產生蓄積[4-6]。研究表明，五氯酚對人體造成的毒性有急性中毒[7]、生殖毒性[8，9]、致畸毒性[10]、遺傳毒性[11-13]、細胞毒性[14，15]、免疫毒性[16，17]等，五氯酚是包括我國在內的許多國家環境優先監測污染物之一，國際癌癥研究機構（IARC）也將五氯酚列為第Ⅰ類致癌物。2008年，原國家環保總局將PCP列為“高污染、高環境風險”產品[18]。

依據新版CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》中7．6“測量不確定度的評定”要求，開展檢測的實驗室應評定測量不確定度。本研究依據JJF 1059．1-2012《測量不確定度評定與表示》技術規范[19]，借鑒本實驗室化學分析不確定度評定方法[20]，擬建立GC-MS測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定方法。通過對測量過程和測量系統的深入分析研究，識別不確定度來源，列出影響測定結果的不確定度因素，同時計算各標準不確定度分量和相對擴展不確定度，最后評估各分量對合成不確定的相對貢獻，從而為GC-MS內標法測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑 五氯酚標準儲備液（100μg/ml）（農業部環境保護科研監測所）；2，4-二溴酚（德國Dr公司）；正己烷、乙酸乙酯、乙腈和丙酮（色譜純，德國Merk公司）；吡啶和碳酸鉀（分析純，國藥集團）；乙酸酐（分析純，西隴科學）；三氯乙酸（分析純，科密歐公司）；SLC固相萃取小柱（500mg/6ml，杭州福裕科技服務有限公司）。

1．2 儀器與設備 7890B-7000C氣相色譜-質譜聯用儀（美國 Agilent公司）；SORVALL LYNX6000 高速冷凍離心機（美國Thermo）；AH-30勻漿機（上海睿科）。

1．3 儀器條件 色譜條件：色譜柱：DB-5MS（30m×0．25mm×0．25μm）；柱溫：初溫 80℃，保持 2min，以10℃/min升至 250℃，290℃后運行 4min；進樣口溫度：230℃；載氣流速：1．0ml/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1μl。質譜條件：電離方式：EI源，70eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲：10min；掃描方式：選擇離子掃描（SIM）；五氯苯乙酸酯（五氯酚）定性離子 264、268、308，定量離子：266；內標 2，4-二溴苯乙酸酯（2，4-二溴酚）定性離子 250、254，定量離子：252。

1．4 樣品前處理 參照《2018年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》。

步驟1：稱樣：稱取豬肉、雞肉等動物組織5．00g 絞碎樣品入離心管內，加入 30μl 10．0μg/ml 2，4-二溴酚內標液。

步驟2：提取：上述樣品中加入5%三氯乙酸溶液進行勻漿，加入10ml提取液（乙酸乙酯：正己烷=1：9，V/V）提取，提取液離心后，取上層有機相氮吹干，加入乙腈復溶后再離心。

步驟3：凈化：SLC固相萃取柱活化后，取步驟2離心后的復溶液過柱并洗脫收集，洗脫液氮吹至0．5ml左右。

步驟4：衍生：步驟3殘余物中加衍生溶劑（乙酸酐：吡啶=1：1，V/V）0．2ml進行衍生后，加 1ml正己烷提取，再加碳酸鉀溶液靜置分層，取上層有機相供GC-MS測定。

步驟5：取0．25ml五氯酚標準儲備液（100μg/ml）用色譜純丙酮稀釋至 25ml，得到 1．0μg/ml使用液。 再取 10μl、25μl、50μl、100μl、200μl五氯酚標準使用液 （1．0μg/ml）， 分別加入 30μl 10．0μg/ml 2，4-二溴酚內標液，同步驟4進行衍生反應。

步驟6：在相同條件下分別測定標準溶液和樣品溶液，制作工作曲線。

步驟7：利用工作曲線，按以下公式計算樣品中五氯酚鈉含量X。五氯酚鈉含量測量結果由2次測量的平均值給出。

1．5 計算公式 利用GC-MS方法測定五氯酚鈉含量X的表示式為：

式中：X—樣品中五氯酚鈉含量，μg/kg；

c—從標準曲線中得到的樣品溶液中五氯酚含量，μg/L；

V—試樣溶液的定容體積，ml；

m—試樣質量，g；

1．08—五氯酚轉化成五氯酚鈉系數。

2 結果與分析

2．1 不確定度來源分析 根據 CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》要求，實驗室應識別測量不確定度的貢獻，評定測量不確定度時，應采用適當的分析方法考慮所有顯著貢獻。根據JJF 1059．1-2012[19]技術規范，合成標準不確定度組成包括A類標準不確定度和B類標準不確定度。測量重復性引入的標準不確定度分量采用A類評定方法；標準物質定值、擬合校準曲線、移液器、容量瓶、溫度變動、天平和GC-MS儀器等因素引入的標準不確定度分量采用B類評定方法。其它諸如內標物質定值和配制過程引入的不確定度對本實驗影響較小，故本文未做討論。本方法不確定度來源主要組成見圖1。

圖1 不確定度主要來源分析

2．2 不確定度分量評定

2．2．1 A類標準不確定度UArel評定 在重復性條件下，對同一試樣從取樣開始獨立重復測量7次，測量數據見表1。

方法規定，五氯酚含量由2份樣品的測量結果平均值給出為X=3．65μg/kg，所以五氯酚含量測量重復性引入的相對標準不確定度UArel為

2．2．2 B 類標準不確定度 UBrel評定

2．2．2．1 體積V的標準不確定度評定 容量瓶引入的體積V標準不確定度分量UB1rel（V）實驗過程用到25ml容量瓶對五氯酚儲備液進行稀釋，根據JJG 196-2006《中華人民共和國國家計量檢定規程常用玻璃量器》[21]制造商提供的A級容量瓶在20℃時的體積為 25±0．04ml，假設為三角形分布，包含因子 kB1（V）=。由此引入的相對標準不確定度 UB1rel（V）為

表1 7份試樣五氯酚含量獨立重復測定結果

溫度引入的體積V標準不確定度分量UB2rel（V）容量瓶已在20℃校準，而實驗室的溫度在（20±5）℃之間變化。丙酮的體積膨脹系數為 1．43×10-3℃-1，服從均勻分布，區間半寬度為 5℃×1．43×10-3℃-1=7．15×10-3，包含因子 kB2（V）=，由此引入的相對標準不確定度 UB2rel（V）為

移液器引入的體積V標準不確定度分量UB3rel（V）配制五氯酚使用液時，需要用量程100-1000μl的移液槍移取儲備液，根據檢定證書，這支移液槍的相對誤差為0．4%，假設為三角分布，kB3-1（V）=，因此移取250μl溶液產生的相對標準不確定度 UB3-1rel（V）為

配制五氯酚工作曲線時需要用量程

10-100μl和20-200μl的移液槍移取使用液，根據檢定證書，兩支移液槍的相對誤差分別為1．4%和2．8%，假設為三角分布，kB3-2（V）=，因此移取10μl、25μl、50μl、100μl、200μl溶液產生的相對標準不確定度分別為 0．57%、0．57%、0．57%、0．57%、1．14%。移液槍引入的不確定度分量互不相關，采用方和根方法合成：

體積 V的 3個不確定度分量 UB1rel（V）、UB2rel（V）和 UB3rel（V）互不相關，采用方和根方法合成

2．2．2．2 標準物質定值 W 的不確定度 UBrel（W）評定由標準物質證書可知，五氯酚不確定度為0．08μg/ml，假設服從均勻分布，包含因子kB（W）=，由此引入的相對標準不確定度UBrel（W）為

2．2．2．3 擬合校準曲線 C 的不確定度 UBrel（C）評定校準曲線采用5個濃度的標準溶液擬合，每個濃度均進行3次平行試驗，共n=15個校準點，校準曲線公式為Ai=a+bCi

式中，Ci為標準溶液的濃度，μg/ml；Ai為標準溶液濃度Ci的峰面積與內標峰面積的比值；a為截距；b為斜率。由實驗數據計算給出斜率、截距和相關系數如下

Ai=a+bCi=0．0019+0．0022Ci

對試樣進行2次（m=2）平行測量，得到平均峰面積比A0和平均試樣濃度C0為

回歸的標準偏差

由此可計算出最小二乘法擬合校準曲線引入的相對標準不確定度UBrel（C）為

2．2．2．4 儀器 I的不確定度 UBrel（I）評定 天平引入的標準不確定度UB1rel（I）評定 電子天平經檢定合格，由天平檢定證書可知其最大允許誤差為±1．5mg，服從均勻分布，包含因子 kB1（I）=。由此引起的相對標準不確定度UB1rel（I）為

GC-MS引入的標準不確定度UB2rel（I）評定 由GC-MS檢定證書可知，取包含因子kB2（I）=2時，GC-MS的相對擴展不確定度為4%。由此引起的相對標準不確定度 UB2rel（I）為

儀器I的2個不確定度分量UB1rel（I）和UB2rel（I）互不相關，采用方和根方法合成

2．2．2．5 合成B類不確定度 本實驗過程中各B類不確定度分量互不相關，綜合以上分量結果，采用方和根方法合成B類標準不確定度

2．3 相對合成標準不確定度評定 將A類和B類標準不確定度采用方和根方法合成，計算五氯酚鈉含量的相對合成標準不確定度

2．4 相對擴展標準不確定度評定 取包含因子k=2，包含概率P≈95%，則樣品中五氯酚鈉含量測量結果的相對擴展不確定度Urel為

2．5 五氯酚鈉含量測量結果及其不確定度報告五氯酚鈉含量測量結果由2份試樣的平均值給出為X=3．68μg/kg。五氯酚鈉含量測量結果的相對擴展不確定度Urel=17%，由合成標準不確定度乘以包含因子k=2給出，提供P≈95%的包含概率。見表2。

表2 五氯酚鈉含量X測量結果的不確定度分量匯總表

3 討論

本文通過對GC-MS法測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度進行評定，通過較全面的分析檢測過程中的不確定度來源，計算各不確定度分量，從表2來看，擬合工作曲線對本實驗過程不確定貢獻最大，占58．8%，這與多數評定氣相色譜法測量過程不確定度的研究結果一致；其次是GC-MS、移液槍校準和測量重復性引入的不確定度對評定結果的影響， 分別占 15．1%、12．2%和 9．8%。 容量瓶、溫度、標準物質和天平等因素對不確定度貢獻相對較小。建議通過增加樣品和標準曲線每個濃度的測定次數、提高檢驗人員的操作規范性和熟練程度等措施來降低測量不確定度，提高結果的準確性和可靠性。