Pooling PCR技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)病程早期HIV感染者的研究

唐翼龍 ，易志強(qiáng) ，劉麗萍 ，靳廷麗 ，張娜 ，丁晨 ，廖清華

(1．江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029；2．深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055)

在艾滋病防治中，找到HIV感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的科學(xué)方法之一。在病程早期（急性感染期），感染者體內(nèi)的艾滋病病毒復(fù)制活躍，其通過性行為等途徑感染配偶/性伴的效率最高，如能在這個(gè)階段就將這些HIV感染者診斷出來，有利于感染者本人通過自身行為改變或疾病防控部門采取適當(dāng)措施切斷傳播途徑，可以減少”二代病例”的產(chǎn)生，非常有利于艾滋病疫情的控制。第3版《國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊》據(jù)此推薦急性感染期HIV攜帶者應(yīng)當(dāng)接受治療[1]。實(shí)際工作中，常使用WB法抗體檢測技術(shù)診斷高危行為者是否感染HIV病毒。但是，人體從接觸病毒到產(chǎn)生較高滴度的抗體，一般要4周左右的時(shí)間，所以HIV抗體檢測技術(shù)難以發(fā)現(xiàn)病程早期的HIV感染者。而Pooling PCR是一種核酸檢測技術(shù)，它利用核酸的體外高效指數(shù)擴(kuò)增原理，在急性感染期即可檢測出艾滋病高危行為者的血樣中是否存在HIV病毒RNA，在病程早期就可以對就診者/求詢者的艾滋病病毒的感染狀況做出診斷[2]；同時(shí)，這種技術(shù)也適合用于處理大批量的臨床樣本。國內(nèi)已有單位將Pooling PCR技術(shù)應(yīng)用于獻(xiàn)血員的血液篩查[3]，但未見有在男男同性戀（MSM）、性病門診就診者、其他就診者等等人群中應(yīng)用的報(bào)道。本項(xiàng)目聯(lián)合江西省內(nèi)4家醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，在男男同性戀者、性病門診就診者、其他就診者等人群中開展Pooling PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用性研究，探討該技術(shù)在醫(yī)療機(jī)構(gòu)各就診人群中應(yīng)用的可行性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 對象 2016年7月-12月，在南昌市轄區(qū)內(nèi)收集4家醫(yī)療機(jī)構(gòu)留存的男男同性戀人群 （疾控中心VCT門診）、性病門診就診者（專科醫(yī)院，部分樣本）、其他就診者（省級綜合性醫(yī)院，部分樣本）、體檢人群（省級綜合性醫(yī)院，部分樣本）的HIV抗體陰性血樣；從艾滋病防治信息系統(tǒng)中導(dǎo)出相應(yīng)單位同時(shí)期的檢測數(shù)據(jù)。

1．2 儀器與試劑 儀器為羅氏cobas AmpliPrep/TaqMan全自動(dòng)核酸檢測系統(tǒng)；試劑為配套的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2．0。

1．3 方法 集合核酸法[4]

1．3．1 樣品集合程序 在登記表格上記錄一級和二級集合及對應(yīng)的原始樣品編號；吸取130μl樣品，移入標(biāo)記二級集合的離心管中；10例樣品形成一個(gè)1300μl的二級集合樣品，充分渦旋震蕩混勻；從5個(gè)二級集合管中分別吸取210μl樣品，移入標(biāo)記有一級集合的離心管中，形成由50例樣品1050μl體積組成的一級集合樣品，充分渦旋震蕩混勻；從每個(gè)一、二級集合管中吸取1000μl集合樣品，分裝至另一相應(yīng)標(biāo)記的S-tube管，用羅氏病毒載量檢測試劑進(jìn)行檢測；制備陰性集合外部質(zhì)控品：使用50例HIV抗體和核酸陰性樣品，按上述步驟，分別集合成5個(gè)陰性二級集合外部質(zhì)控品和1個(gè)一級集合外部質(zhì)控品；制備陽性集合外部質(zhì)控品：從9例HIV抗體和核酸陰性樣品和一份至少含有HIV RNA103c/ml陽性樣品中，分別移取130μl加入離心管中，形成一個(gè)1300μl的陽性二級集合外部質(zhì)控品。再分別從4個(gè)已制備好的陰性二級集合外部質(zhì)控品和上述陽性二級集合外部質(zhì)控品中，移取210μl至標(biāo)記為一級陽性集合外部質(zhì)控品的離心管中，形成一級陽性集合外部質(zhì)控品；一級和二級陰、陽性集合外部質(zhì)控品分別用于RT-PCR中每一輪一級和二級集合樣品的檢測。

1．3．2 樣品的分解檢測程序 用羅氏CTM96病毒載量儀及配套的試劑盒對一級集合樣品進(jìn)行檢測，陽性反應(yīng)的一級集合樣品進(jìn)入下一檢測步驟；用上述檢測方法對所有組成陽性一級集合的二級集合樣品進(jìn)行檢測，陽性反應(yīng)的二級集合樣品進(jìn)入下一檢測步驟；用上述檢測方法檢測所有組成陽性二級集合樣品的的10例單個(gè)樣品，確定核酸陽性的單個(gè)樣品。

2 結(jié)果

2．1 不同人群HIV核酸陽性率情況 本研究共收集樣本2644例，其中，男男同性戀人群全部樣本做了核酸檢測；其它3類人群因研究經(jīng)費(fèi)所限，只抽取了部分抗體陰性的樣本做核酸檢測。但HIV抗體陽性的樣本通過給病人做HIV病毒載量的途徑全部做了核酸檢測。男男同性戀人群HIV核酸陽性率為554．27/萬，根據(jù)徐紅等人報(bào)道，感染率更高[5]；性病門診就診者人群次之，為不低于119．13/萬，數(shù)據(jù)高于古彩虹[6]等人報(bào)道，低于鄭伯敏[7]報(bào)道，與李桂英[8]等人報(bào)道接近；體檢人群沒有發(fā)現(xiàn)HIV核酸陽性；醫(yī)療機(jī)構(gòu)1的其他就診者人群核酸陽性率（≥85．54/萬）要高于醫(yī)療機(jī)構(gòu)2的其他就診者人群（≥21．04/萬）。4個(gè)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)所留存的4類人群的抗體檢測陰性樣本中有2類人群檢出HIV病毒核酸陽性，共檢出病程早期感染（HIV抗體陰性，但核酸陽性）樣本3例，其中男男同性戀人群檢出2例、性病門診就診者人群檢出1例。見表1。

2．2 Pooling PCR檢測技術(shù)成本分析 一般國產(chǎn)第三代酶聯(lián)HIV抗體檢測試劑均價(jià)5元/人份左右；發(fā)光法檢測試劑則成本稍高，為25元/人份左右。對于Pooling PCR方法，1份檢測試劑價(jià)格在500元左右。但是，如果混合50例樣本做一個(gè)Pool，則相當(dāng)于10元/人份樣本，如混合100例樣本做一個(gè)Pool，則檢測試劑成本低至5元/人份樣本。集合的大小可以根據(jù)工作經(jīng)費(fèi)情況來定。工作經(jīng)費(fèi)充足，則可以做小集合（50例樣本），用于發(fā)現(xiàn)更低HIVRNA拷貝數(shù)的患者；工作經(jīng)費(fèi)相對不足，則可以做較大的集合（100份樣本）。

表1 4個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中4類就診人群HIV核酸陽性率情況

3 討論

在艾滋病防制中，找到病毒感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的有效方法。最理想的情況是，在病程早期即急性感染階段即將HIV病人診斷出來，從而避免配偶/性伴之間的傳播[9]。因方法本身的局限性，用抗體檢測技術(shù)篩查高危人群時(shí)，會(huì)導(dǎo)致“漏掉”病程早期（急性感染期）的那一部分感染者；因?yàn)椋梭w免疫系統(tǒng)接觸到病毒后一般要4周左右的時(shí)間才能產(chǎn)生較高滴度的抗體，所以，使用HIV抗體檢測方法難以發(fā)現(xiàn)早期艾滋病病毒感染者。而Pooling PCR方法正好可以解決這個(gè)問題。它是一種核酸檢測技術(shù)，它可以檢測出有高危行為者的血樣中的HIV病毒RNA，在疾病早期就可以對就診病人的艾滋病病毒的感染狀況做出診斷。本研究提示男男同性戀（MSM）[10]、性病門診就診者（STD)人群檢HIV核酸陽性率分別排第一、第二位。其中男男同性戀人群HIV核酸陽性率為 554．27/萬，與李東民等人報(bào)道接近[11]；性病門診就診者人群次之，為不低于 119．13/萬[12，13]。 這2類人群均檢出急性感染期的HIV病毒攜帶者。另外，即使同為“其他就診者”人群，兩個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的這個(gè)人群的核酸陽性率也有差異，原因在于，“醫(yī)療機(jī)構(gòu)1”為結(jié)核病收治醫(yī)院，艾滋病病毒感染者更有可能因發(fā)熱、皮膚疾病、咳嗽 （結(jié)核病引起）、腹瀉等非特異性傳染病癥狀而去傳染病醫(yī)院求診，進(jìn)而被診斷出來[14]。理論上來說，在傳染病醫(yī)院或感染科/發(fā)熱門診也更有可能發(fā)現(xiàn)早期HIV攜帶者[15]。眾所周知，在HIV感染的早期階段即開始抗病毒治療，有利于感染者的免疫重建，從而有利于病人的救治；更為重要的是，因?yàn)椴〕淘缙冢毙愿腥酒冢┌滩〔《靖腥菊唧w內(nèi)病毒復(fù)制活躍，其通過性行為等途徑感染配偶/性伴的效率最高，如能在此時(shí)將這些感染者診斷出來，非常有利于感染者本人通過行為改變及衛(wèi)生防疫部門采取適當(dāng)措施切斷傳播途徑，以減少二代病例的產(chǎn)生，非常有利于艾滋病疫情的防控。

綜上可見，Pooling PCR技術(shù)較抗體檢測方法更為敏感。本人早前的研究表明，自愿咨詢檢測者及其他就診者是江西省HIV感染者病例報(bào)告數(shù)多且感染率高的人群[16]，預(yù)期使用Pooling PCR技術(shù)能在這兩類人群中發(fā)現(xiàn)早期HIV感染者，后續(xù)可以做擴(kuò)大樣本的研究。建議將該方法推廣應(yīng)用于男男同性戀、性病門診就診者、自愿咨詢檢測者及其他就診者（感染科病人），作為這幾類人群的常規(guī)檢測手段，用于診斷病程早期（HIV抗體陰性但核酸陽性）的艾滋病病毒感染者。另外，應(yīng)用Pooling PCR檢測技術(shù)檢測的是混合樣本，人均檢測成本并不高。所以，這方法用于就診的其他人群也是可行的。在實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)能力、設(shè)備條件都具備的情況下，可以考慮用Pooling PCR檢測技術(shù)取代HIV抗體檢測方法。