Pooling PCR技術用于發現病程早期HIV感染者的研究

唐翼龍 ，易志強 ，劉麗萍 ，靳廷麗 ，張娜 ，丁晨 ，廖清華

(1．江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029；2．深圳市疾病預防控制中心，廣東 深圳 518055)

在艾滋病防治中，找到HIV感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的科學方法之一。在病程早期（急性感染期），感染者體內的艾滋病病毒復制活躍，其通過性行為等途徑感染配偶/性伴的效率最高，如能在這個階段就將這些HIV感染者診斷出來，有利于感染者本人通過自身行為改變或疾病防控部門采取適當措施切斷傳播途徑，可以減少”二代病例”的產生，非常有利于艾滋病疫情的控制。第3版《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》據此推薦急性感染期HIV攜帶者應當接受治療[1]。實際工作中，常使用WB法抗體檢測技術診斷高危行為者是否感染HIV病毒。但是，人體從接觸病毒到產生較高滴度的抗體，一般要4周左右的時間，所以HIV抗體檢測技術難以發現病程早期的HIV感染者。而Pooling PCR是一種核酸檢測技術，它利用核酸的體外高效指數擴增原理，在急性感染期即可檢測出艾滋病高危行為者的血樣中是否存在HIV病毒RNA，在病程早期就可以對就診者/求詢者的艾滋病病毒的感染狀況做出診斷[2]；同時，這種技術也適合用于處理大批量的臨床樣本。國內已有單位將Pooling PCR技術應用于獻血員的血液篩查[3]，但未見有在男男同性戀（MSM）、性病門診就診者、其他就診者等等人群中應用的報道。本項目聯合江西省內4家醫療衛生機構，在男男同性戀者、性病門診就診者、其他就診者等人群中開展Pooling PCR檢測技術的應用性研究，探討該技術在醫療機構各就診人群中應用的可行性，現報告如下。

1 材料與方法

1．1 對象 2016年7月-12月，在南昌市轄區內收集4家醫療機構留存的男男同性戀人群 （疾控中心VCT門診）、性病門診就診者（?？漆t院，部分樣本）、其他就診者（省級綜合性醫院，部分樣本）、體檢人群（省級綜合性醫院，部分樣本）的HIV抗體陰性血樣；從艾滋病防治信息系統中導出相應單位同時期的檢測數據。

1．2 儀器與試劑 儀器為羅氏cobas AmpliPrep/TaqMan全自動核酸檢測系統；試劑為配套的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2．0。

1．3 方法 集合核酸法[4]

1．3．1 樣品集合程序 在登記表格上記錄一級和二級集合及對應的原始樣品編號；吸取130μl樣品，移入標記二級集合的離心管中；10例樣品形成一個1300μl的二級集合樣品，充分渦旋震蕩混勻；從5個二級集合管中分別吸取210μl樣品，移入標記有一級集合的離心管中，形成由50例樣品1050μl體積組成的一級集合樣品，充分渦旋震蕩混勻；從每個一、二級集合管中吸取1000μl集合樣品，分裝至另一相應標記的S-tube管，用羅氏病毒載量檢測試劑進行檢測；制備陰性集合外部質控品：使用50例HIV抗體和核酸陰性樣品，按上述步驟，分別集合成5個陰性二級集合外部質控品和1個一級集合外部質控品；制備陽性集合外部質控品：從9例HIV抗體和核酸陰性樣品和一份至少含有HIV RNA103c/ml陽性樣品中，分別移取130μl加入離心管中，形成一個1300μl的陽性二級集合外部質控品。再分別從4個已制備好的陰性二級集合外部質控品和上述陽性二級集合外部質控品中，移取210μl至標記為一級陽性集合外部質控品的離心管中，形成一級陽性集合外部質控品；一級和二級陰、陽性集合外部質控品分別用于RT-PCR中每一輪一級和二級集合樣品的檢測。

1．3．2 樣品的分解檢測程序 用羅氏CTM96病毒載量儀及配套的試劑盒對一級集合樣品進行檢測，陽性反應的一級集合樣品進入下一檢測步驟；用上述檢測方法對所有組成陽性一級集合的二級集合樣品進行檢測，陽性反應的二級集合樣品進入下一檢測步驟；用上述檢測方法檢測所有組成陽性二級集合樣品的的10例單個樣品，確定核酸陽性的單個樣品。

2 結果

2．1 不同人群HIV核酸陽性率情況 本研究共收集樣本2644例，其中，男男同性戀人群全部樣本做了核酸檢測；其它3類人群因研究經費所限，只抽取了部分抗體陰性的樣本做核酸檢測。但HIV抗體陽性的樣本通過給病人做HIV病毒載量的途徑全部做了核酸檢測。男男同性戀人群HIV核酸陽性率為554．27/萬，根據徐紅等人報道，感染率更高[5]；性病門診就診者人群次之，為不低于119．13/萬，數據高于古彩虹[6]等人報道，低于鄭伯敏[7]報道，與李桂英[8]等人報道接近；體檢人群沒有發現HIV核酸陽性；醫療機構1的其他就診者人群核酸陽性率（≥85．54/萬）要高于醫療機構2的其他就診者人群（≥21．04/萬）。4個醫療衛生機構所留存的4類人群的抗體檢測陰性樣本中有2類人群檢出HIV病毒核酸陽性，共檢出病程早期感染（HIV抗體陰性，但核酸陽性）樣本3例，其中男男同性戀人群檢出2例、性病門診就診者人群檢出1例。見表1。

2．2 Pooling PCR檢測技術成本分析 一般國產第三代酶聯HIV抗體檢測試劑均價5元/人份左右；發光法檢測試劑則成本稍高，為25元/人份左右。對于Pooling PCR方法，1份檢測試劑價格在500元左右。但是，如果混合50例樣本做一個Pool，則相當于10元/人份樣本，如混合100例樣本做一個Pool，則檢測試劑成本低至5元/人份樣本。集合的大小可以根據工作經費情況來定。工作經費充足，則可以做小集合（50例樣本），用于發現更低HIVRNA拷貝數的患者；工作經費相對不足，則可以做較大的集合（100份樣本）。

表1 4個醫療機構中4類就診人群HIV核酸陽性率情況

3 討論

在艾滋病防制中，找到病毒感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的有效方法。最理想的情況是，在病程早期即急性感染階段即將HIV病人診斷出來，從而避免配偶/性伴之間的傳播[9]。因方法本身的局限性，用抗體檢測技術篩查高危人群時，會導致“漏掉”病程早期（急性感染期）的那一部分感染者；因為，人體免疫系統接觸到病毒后一般要4周左右的時間才能產生較高滴度的抗體，所以，使用HIV抗體檢測方法難以發現早期艾滋病病毒感染者。而Pooling PCR方法正好可以解決這個問題。它是一種核酸檢測技術，它可以檢測出有高危行為者的血樣中的HIV病毒RNA，在疾病早期就可以對就診病人的艾滋病病毒的感染狀況做出診斷。本研究提示男男同性戀（MSM）[10]、性病門診就診者（STD)人群檢HIV核酸陽性率分別排第一、第二位。其中男男同性戀人群HIV核酸陽性率為 554．27/萬，與李東民等人報道接近[11]；性病門診就診者人群次之，為不低于 119．13/萬[12，13]。 這2類人群均檢出急性感染期的HIV病毒攜帶者。另外，即使同為“其他就診者”人群，兩個醫療機構的這個人群的核酸陽性率也有差異，原因在于，“醫療機構1”為結核病收治醫院，艾滋病病毒感染者更有可能因發熱、皮膚疾病、咳嗽 （結核病引起）、腹瀉等非特異性傳染病癥狀而去傳染病醫院求診，進而被診斷出來[14]。理論上來說，在傳染病醫院或感染科/發熱門診也更有可能發現早期HIV攜帶者[15]。眾所周知，在HIV感染的早期階段即開始抗病毒治療，有利于感染者的免疫重建，從而有利于病人的救治；更為重要的是，因為病程早期（急性感染期）艾滋病病毒感染者體內病毒復制活躍，其通過性行為等途徑感染配偶/性伴的效率最高，如能在此時將這些感染者診斷出來，非常有利于感染者本人通過行為改變及衛生防疫部門采取適當措施切斷傳播途徑，以減少二代病例的產生，非常有利于艾滋病疫情的防控。

綜上可見，Pooling PCR技術較抗體檢測方法更為敏感。本人早前的研究表明，自愿咨詢檢測者及其他就診者是江西省HIV感染者病例報告數多且感染率高的人群[16]，預期使用Pooling PCR技術能在這兩類人群中發現早期HIV感染者，后續可以做擴大樣本的研究。建議將該方法推廣應用于男男同性戀、性病門診就診者、自愿咨詢檢測者及其他就診者（感染科病人），作為這幾類人群的常規檢測手段，用于診斷病程早期（HIV抗體陰性但核酸陽性）的艾滋病病毒感染者。另外，應用Pooling PCR檢測技術檢測的是混合樣本，人均檢測成本并不高。所以，這方法用于就診的其他人群也是可行的。在實驗室人員技術能力、設備條件都具備的情況下，可以考慮用Pooling PCR檢測技術取代HIV抗體檢測方法。