建立梯度模型探討溶血對TMA核酸檢測的影響

田耘博，魏蘭，李維，歐陽熊妍

(重慶市血液中心，重慶 400015)

血液病毒核酸檢測（nucleic acid testing，NAT）直接檢測病毒核酸，與酶聯免疫吸附法(ELISA)相比能縮短血液病毒檢測的窗口期，更好地保障血液安全，已成為許多國家血液篩查病毒的必要手段[1，2]，目前我國也已全面開展血液病毒核酸檢測[3]。標本采集、處理、保存等因素對保證NAT檢測結果的準確性尤為重要[4]。若標本采集、處理不當可能導致溶血，血漿中Hb可能會影響血液病毒核酸檢測的有效性和準確性[5-7]。如果實驗室一概拒收溶血標本，重新采集標本可能會非常困難，甚至會影響血液的有效及時供給，產生或增大血液供給矛盾。從母袋內重新留樣進行ELISA和NAT檢測，有可能因抗凝劑的稀釋造成弱陽性標本漏檢[8]；除了稀釋的影響外，母袋重新留樣還可能面臨核酸降解及污染的問題。因此，探討標本溶血對NAT檢測結果的影響意義重大，可為實驗室提供可接受的溶血范圍，保護珍貴的血液資源。

目前應用于血液病毒篩查的NAT技術主要有多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術和轉錄介導的擴增（transcription mediated amplifi-cation，TMA）技術[2]。PCR是最早應用的核酸擴增技術，但隨著NAT在全世界的成功推廣，TMA在NAT中的應用范圍已不亞于PCR[9]。調研文獻發現，目前國內外尚無標本溶血對基于TMA技術的NAT檢測結果影響較為詳細的研究。因此，本研究旨在通過建立梯度溶血程度和梯度病毒載量的標本模型，分析含不同病毒載量的系列溶血程度標本的NAT結果，探討溶血對血液病毒核酸檢測的影響，以明確溶血程度與NAT靈敏度之間的關系，為實驗室提供可接受的溶血范圍，保護血液資源，以促進臨床輸血檢驗技術發展。

1 材料與方法

1．1 標本來源及篩選 收集重慶市血液中心2017年5月-2017年7月經體檢和血液初篩檢驗合格的無償獻血標本500份，分別用含分離膠的“非可替”抗凝真空管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集6～8ml全血用于NAT檢測；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集4～5ml全血用于ELISA檢測。采集后的標本管置于4℃保存，在采集4～6h內2000g離心15min，檢測前置于4℃保存，分別進行ELISA和NAT。挑選ELISA和NAT均為非反應性的標本，封口膠密封后4℃保存，1周內使用。本研究方案獲得重慶市血液中心倫理委員會的批準。

1．2 主要儀器 TEKEN RSP150/200型全自動加樣儀（瑞士TEKEN公司）和FAME 2420/30全自動酶免 分 析 儀 （瑞 士 HAMILTON公 司 ）、Procleix TIGRIS全自動核酸檢測分析系統 （西班牙蓋立復公司）及配套的PRI(試劑準備溫育器，美國Chiron公司)、M-series AD血細胞分析儀（瑞典MEDONIC公司）、RT3100洗板機 （深圳雷杜公司）、EXL808酶標儀（美國BIO-TEK公司）、L535R離心機（湖南湘儀公司）、KQ218超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲波儀器有限公司）。

1．3 主要試劑

1．3．1 ELISA檢測試劑 乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑：北京萬泰、英國索林；丙型肝炎病毒抗體診斷試劑：北京萬泰、美國強生；HIV（1+2）P24 抗原及抗體診斷試劑：法國伯樂，HIV抗體診斷試劑：上?？迫A。

1．3．2 核酸檢測試劑 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1型）NAT試劑盒（TMA-化學發光法）”（Procleix Ultrio Plus Assay）， 美國Hologic公司。該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA和 HBV DNA，試劑盒內含有配套的Procleix Plus HIV-1/HBV/HCV鑒別試劑。

1．3．3 病毒標準品 HIV、HCV、HBV 的血漿病毒質控品（北京萬泰公司），均為有證標準物質，濃度分別為：HIV 200IU/ml、HCV 30IU/ml、HBV 30IU/ml。

1．4 梯度溶血程度和梯度病毒載量的實用性研究標本模型建立

1．4．1 梯度溶血程度和梯度病毒載量 根據所用檢測試劑說明書[10]和參考類似研究[11-13]，我們將本研究的溶血程度分為5個梯度，血漿Hb濃度從低到高依次為 0g/L（肉眼觀察無溶血）、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L。因病毒載量過低時易出現檢測陰性，將難以判定是溶血導致假陰性還是低病毒載量下檢出率較低的影響，所以本研究根據試劑說明書的檢測下限和有關核酸檢測質控品濃度設置的研究報道[14]，將病毒濃載量分為2個水平，低水平組：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml； 高 水 平 組 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml。

1．4．2 創建梯度溶血程度和梯度病毒載量的標本模型 將商品化的HIV、HCV、HBV核酸檢測血漿病毒質控品作為病毒標準品，進行稀釋建立梯度病毒載量的標本。為避免基質效應[15]，采用NAT和ELISA檢測均合格的無溶血血漿作為稀釋液，按實驗設計的病毒載量水平對標準品進行稀釋。

1．4．3 溶血模型的制備 取NAT和 ELISA檢測均合格的核酸標本管中壓積紅細胞，與等量去離子水混勻后使用超聲波破碎紅細胞，具體的超聲波破碎紅細胞裝置如圖1所示，采用去離子水煮沸冷卻后制得的脫氣水作為聲傳導介質[16]。具體操作流程如下：超聲波作用5min→顛倒混勻10次→超聲波再次作用5min→顛倒混勻10次→2000g離心15min→轉移上半部分液體到潔凈試管，作為溶血標本原液，血細胞分析儀檢測其Hb濃度。用血細胞分析儀測量離心后的溶血血漿Hb濃度[17]，與已知病毒載量的標準品混合，通過經檢驗合格的無溶血血漿調節含病毒的溶血標本體積，配制成按實驗設計的Hb濃度和病毒載量。溶血程度Hb為40g/L時的具體配比見表1，其余Hb梯度濃度的配比按照設定的濃度計算，進行配制。

1．4．4 測試標本的準備 根據試劑說明書， 每次NAT檢測需500μl樣本，為確保樣本量的充足，本研究每支測試標本量為1ml。測試標本管按病毒含量分為對照組（不含病毒）、低水平組、高水平組，按溶血程度（Hb 濃度）分為 0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 5個組。

表1 Hb濃度為40g/L時病毒高低水平組測試標本的配制

圖1 超聲波致紅細胞溶血裝置示意圖

1．4．5 溶血模型的驗證 按上述方法配制的溶血模型，在每次進行核酸檢測前，均同時取一支對照管在血細胞分析儀上進行檢測，驗證血紅蛋白含量是否達到預期值。

1．5 檢測過程 本研究實驗在重慶市血液中心現有的NAT全自動系統PROCLEIX TIGRIS上進行，采用的配套的試劑。根據試劑盒說明書[10]，HIV、HCV、HBV病毒聯檢和鑒別檢測之間的特異性和靈敏度沒有顯著性差異。因此我們采用HIV、HCV、HBV病毒聯檢的方式進行檢測實驗。本研究進行了3批次總計240個標本的檢測。每批次檢測的標本包括HIV、HCV、HBV每種病毒的高低2個病毒載量水平，每個水平分別包括Hb 5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 4個梯度濃度，每個梯度濃度的標本平行配制3管；Hb為0g/L，即不溶血時，高病毒載量水平組能確定檢出[10，14]，因此只配制了低病毒載量水平組，每種病毒1個，用作研究測試的質控管；在每批次測試時，對每個Hb的梯度濃度級別，均配制1個不含病毒的對照管，因此每批的測試標本數為80個。具體核酸檢測操作參見相關核酸檢測研究文章[18]。

1．6 數據統計和分析 將各測試標本的數據輸入電腦，采用Microsoft Excel軟件進行記錄，用SAS8．1統計軟件進行分析。溶血模型的Hb濃度驗證進行總體均數的區間估計，采用t檢驗的方式進行均值顯著性檢驗，顯著性水平α=0．05，P＜α為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 溶血標本的驗證結果 本研究所建立的Hb梯度濃度溶血模型中的Hb濃度，均在95%的置信區間范圍內，P值均大于α，因此，每個Hb梯度內各標本管的Hb濃度比較差異無統計學意義。見表2。

表2 溶血標本驗證測試結果

2．2 核酸檢測結果 本研究3個測試批次，每批次80個，共計240個測試標本。Hb分別為0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L 的梯度濃度， 病毒載量分別是 高 水 平 組 ：HIV 60IU/ml、HCV 20IU/ml、HBV 15IU/ml， 低 水 平 組 ：HIV 20IU/ml、HCV 10IU/ml、HBV 5IU/ml，共225個測試標本，均呈反應性。對照管（未加病毒的測試標本）均呈非反應性。見表3。

3 討論

目前在研究溶血對核酸檢測影響的報道中[11-13，19]，采用的溶血方式多為反復凍融、機械破壞等，這些方法耗時較長，雖能將紅細胞膜破壞，但也容易導致Hb的變性。在本研究中，利用超聲波的機械效應、空化效應破碎紅細胞致紅細胞溶血，建立溶血模型，操作時間較短，可提高研究實驗的效率。超聲波致紅細胞溶解的最佳條件需要的聲強不高[16]，因此利用超聲波清洗儀的超聲波能量，即可對紅細胞進行破壞釋放出其內的血紅蛋白，制得溶血標本。為保證超聲波的傳導效果，減少超聲波由于空化機制在超聲波清洗儀容器內液體中傳導的能量耗損，我們將去離子水通過煮沸后冷卻的方式制成脫氣水，作為聲波傳導介質[16]，比單用普通去離子水更利于聲能傳導，進一步提高了細胞破碎效率。而在制備溶血標本原液時，由于超聲波在全血中的聲能衰減比水中大，為了減少不必要的聲衰減，提高超聲破碎細胞的效能，同時為了避免完全用壓積紅細胞破碎后形成的溶血標本粘度大而難以定量吸取的問題，采用等量去離子水稀釋混勻紅細胞后再用超聲波破碎。充分破碎紅細胞后離心，紅細胞碎片沉降到底部，但離心后標本溶血程度較重，難以肉眼分辨細胞碎片和上層液體的分界線，為盡量避免在吸取溶血標本原液時吸入紅細胞碎片，只吸取離心后的上半部分液體。

表3 測試標本管分組檢測結果

目前，有較多的關于溶血對核酸檢測影響的研究報道，但基本上都集中在基于PCR技術的NAT 方面[11-13，19，20]。這些研究中設置的 Hb 濃度范圍各不相同，多數在20g/L之內，但有的甚至高達240g/L，正常人的Hb通常在160g/L，即便全部溶血，也很難達到那么高。因此，本研究在廣泛查閱類似研究文獻的基礎上，結合所用TMA核酸檢測技術和工作的實際情況，將最高溶血濃度設定在40g/L。從5g/L開始研究，也是基于說明書中明確指出該溶血程度不會影響檢測效果[10]。通過本研究建立Hb濃度梯度模型，每次檢測前同時進行的Hb濃度檢測，對結果進行統計學分析，P值均小于α，因此每個Hb梯度濃度的各標本Hb濃度差異無統計學意義，表明實際的溶血程度達到了預期要求。

通過本研究發現，當溶血程度達到Hb 40g/L時，仍然對檢測結果沒有影響。這個范圍遠高于試劑說明書中Hb≤5g/L時對檢測沒有影響的限度。說明基于TMA的NAT對標本溶血具有較強的抗干擾能力。而對基于PCR的NAT，當標本出現溶血時紅細胞破碎釋放出游離Hb及其衍生物質，這些物質會嚴重降低PCR擴增效率，直接影響NAT檢測結果的準確性[21，22]。溶血對PCR的影響原因，主要是Hb中的血紅素或其代謝產物是DNA聚合酶的抑制劑[23]。有研究發現標本輕度溶血時對HBVDNA定量結果無明顯影響，但重度溶血時存在顯著性影響，且溶血會影響HBV-DNA陽性標本檢測準確性[24]。

TMA核酸檢測技術是在等溫條件下以雙鏈DNA為模板直接轉錄出RNA，最后將擴增的產物——RNA通過雜交保護分析 （hybridization protection assay，HPA）進行化學發光檢測，對于HPA，其采用的化學發光材料為吖啶酯 (Acridinium ester，AE)[10]。在堿性條件下，吖啶酯分子受到過氧化氫（H2O2）攻擊可生成二氧乙烷，二氧乙烷不穩定，分解為CO2和電子激發態的N-甲基吖啶酮，當其回到基態時會發出波長為430nm的光[25]。而Hb的最強烈光吸收主要是由血紅素引起的，在近紫外光 和 可 見 光 主 要 有 578nm、540nm、416nm和342nm四條譜帶（圖2），而416nm的吸收強度比其它幾條譜帶高10倍以上[26]。由于TMA檢測發出的信號波長430nm和Hb的最大吸收波長416nm很接近，如有微量Hb也可能對HPA帶來極大的影響。TMA與核酸序列依賴性擴增（nucleic acid se-quence based amplification，NASBA）技術原理基本一致，而在NASBA方式進行的病毒NAT中，發現溶血對NAT有明顯的抑制作用[27]。在用TMA技術對遺體捐獻者的血液標本進行HIV檢測時，也發現溶血對NAT有小而顯著的影響，導致NAT檢測，甚至重復檢測都會無效[28]。

圖2 Hb的吸收光譜

本研究表明，在Hb濃度≤40g/L時，溶血對TMA技術的核酸檢測沒有明顯影響，其原因可能是在TMA的第一步靶核酸捕獲中，會對沒有結合到磁珠上的非靶核苷酸物質如Hb進行反復的洗脫，將結合病毒核酸分子的磁珠與樣品中的其他成分分離，很大程度上消除了Hb的影響。此外，本研究所用的Procleix Ultro Plus試劑比Procleix Ultro試劑更為靈敏[29]，在成分上增加了強堿LiOH[30]，對蛋白質的變性作用更強，可進一步消除Hb的影響。

綜上，本研究提示在實際的血液病毒核酸檢測中，采用TMA技術的NAT在標本血漿Hb濃度≤40g/L時，標本溶血對核酸檢測結果無顯著性影響。這與其檢測原理和所用試劑成分相關。但本研究尚有不足之處，測試標本量不夠大、未與PCR檢測原理的核酸檢測系統進行平行對比、未考慮稀釋樣本濃度的溯源性，這些問題都有待進一步研究完善。