丙型肝炎流行病學及臨床檢驗技術研究進展

唐立紅，楊桂淇，陳潔晶，龔蔚蔚 綜述，歐明林 審校

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二四醫院中心實驗室、廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林541002)

丙型肝炎（丙肝）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一種以肝損害為主的主要經血液傳播的一組全身性傳染病疾病[1]。HCV的傳播途徑較多[2-5]，除了通過血液傳播之外，也可以通過性傳播、家庭內接觸和母嬰傳播，此外，目前仍有很多HCV患者感染傳播途徑不能明確，這體現了HCV傳播途徑具有綜合性和隱匿性[6]。經統計，全球約有1．85億人感染HCV，感染率約為3%，此外，每年新發HCV感染的病例有300～400萬例左右[7，8]。 在中國，HCV 的感染率約 3．2%，高于世界的平均水平，有約4000萬例感染患者，是世界上HCV感染者最多的國家之一[9，10]。有研究報告指出[11，12]，約有70%的患者可發展成慢性丙型肝炎，約有20%左右的慢性丙肝患者可能發展成慢性肝病、肝硬化或者肝細胞癌。目前，在臨床上還沒有研制出專門有效的丙型肝炎疫苗，因此，尋找靈敏的HCV檢驗途徑、積極預防并做到早發現早治療是避免丙肝發病、影響人類健康最佳方式[13]。本文就目前HCV流行情況及臨床上常用檢測技術的研究進展進行簡要綜述。

1 HCV基因組的結構和特點

HCV是黃病毒科丙型肝炎病毒屬的一類單股正鏈 RNA病毒，全長約 9．6kb，HCV基因組由341bp的5′非編碼區和27kb的3′非編碼區組成，在5′非編碼區下有一可對多聚蛋白前體進行編碼的開放閱讀框（open reading frame，ORF），可編碼種類約3000種[14]。經過多方面的相互作用影響后裂解形成3種結構蛋白質（E1、E2糖蛋白和核心蛋白）和非結構蛋白質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）[15]，它們分別對病毒顆粒的編碼、復制及合成發揮著重要的作用。HCV基因組具有高度的異質性，E1和E2區域是最可變的，而3'UTR和5'UTR和末端區段高度保守[16]。據估計，在慢性感染者中，每天大約產生1012個病毒顆粒，這種顯著的復制率與高度易錯率，使得病毒聚合酶活性相結合時容易產生遺傳多樣性。見圖1。

圖1 丙型肝炎病毒基因組結構及其產物模式圖[17]

2 丙型肝炎在國內外的流行現狀

HCV感染通常具有隱匿性，且有超過50%的感染者會發展成丙型肝炎，其中有1/10的感染者將進一步發展成肝硬化甚至是肝癌[9]。此外，有研究顯示[18]，在這些患者中1%～3%可發展成肝癌，因此臨床預防和早診斷早治療極其重要。據WHO報告，丙肝流行率平均為3．0%，而且每年新發HCV感染約300～400萬例，估計有慢性HCV感染者約1．3～1．7 億，每年導致 35～50 萬患者死亡[19]。 在不同的國家和地區，HCV感染率差異很大。歐洲的流行率為1%，非洲的流行率為5．3%。劉麗[20]在研究HCV感染孕婦中的流行情況中說明，蘇丹孕婦（0．6%）、沙特孕婦（0．7%）、瑞士孕婦（0．71%）、倫敦孕婦（0．8%）低于普通人群的流行率（2．2%～2．3 %）；也門孕婦（8．5%）、埃及孕婦（8．6%）遠遠高于普通人群的流行率。有資料顯示[21]，我國丙肝發病率在2004-2011年期間翻了一倍，發病率逐年上升。2004年的39381例增加到了2011年的73872例；男性的發病率超過女性；報告病例主要集中地區在西北、東北、華北和華中，西北發病率最高，而西北發病率最高的省份是新疆，華東地區發病率最低。文獻分析發現發病率的差異可能與該地區不潔輸血史、吸毒有關[22]；廣西16歲以上高中生HCV感染情況調查[23]顯示，男生抗-HCV陽性率為0．73%(6/823)，女生陽性率為 0．89%(16/1800)，感染率從高到低依次是東部(玉林，1．03%）、中部(柳州，1．28%)、北部(桂林，0．79%)、西部(百色，0．66%)、南部(南寧，0．54%)，公用牙刷史和內窺鏡檢查其感染的高危因素。

3 丙型肝炎的檢測方法及原理

丙型肝炎的檢測方法包括初篩試驗和確認試驗，主要有化學發光試驗、酶聯免疫吸附實驗（ELISA）、免疫印跡試驗、膠體金快速試驗和HCVRNA檢測試驗等。目前，臨床對HCV感染的診斷方法主要是以HCV抗體和HCV-RNA檢測，而HCV抗體的檢測主要是使用化學發光微粒子免疫分析（CMIA）和ELISA檢測方法；HCV-RNA檢測主要是使用PCR-熒光探針法進行檢測。

3．1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）間接法ELISA是抗-HCV檢測的常用篩查方法。原理是以HCV抗原包被固體載體，使用辣根過氧化物酶標記抗人IgG與被檢樣品中的抗-HCV反應，以鄰苯二胺（OPD）等底物顯色后，利用酶標儀等儀器對結果進行陰陽性判定。其主要反應過程如下：將待測樣本加入已包被抗原的反應孔內進行孵育，如標本中含有抗-HCV，則與微孔中的抗原形成固相抗原抗體復合物；因其他免疫球蛋白及樣品中的雜質不能與固相抗原結合，在洗滌過程中將被洗去；加酶結合物經過孵育后，酶結合物連接在抗原抗體復合物上，經洗滌后，在TMB底物參與反應的條件下產生顯色反應，加入終止液，利用MK3酶標儀進行測量分析結果[24]。

ELISA檢測出現假陽性的原因主要有以下幾點：⑴試劑的原因。抗原不純、多克隆抗體和酶結合物純度低等應為生產廠家著重解決的問題；⑵患者的原因。患者血樣溶血或者原發病中有類風濕因子、高免疫蛋白、超氧化物歧化酶等存在；⑶檢驗人員的原因。操作不規范，洗板針堵塞、抽吸不全或注液量不足等。張力[25]探討HCV抗體ELISA 檢測 1＜S/CO 均值＜3．8時假陽性問題中，第一次檢測和第二次檢測（2～6月之間再抽血）比較差異有統計學意義，認為HCV抗體ELISA檢測存在假陽性時應定期復查或做其它檢測。陳紅[26]認為抗-HCV ELISA檢測單試劑陽性標本假陽性高，因此丙肝ELISA檢測灰區設置有其必要性，但設置的范圍有待于進一步的探討。

3．2 化學發光試驗 化學發光微粒子免疫分析（CMIA）能夠將具有高度靈敏的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等檢測分析技術[27]。其檢驗原理是：HCV采用免疫檢測，定性測定人血漿和血清中的HCV抗體，將化學發光微粒子免疫檢測法和靈活的而檢測方案相結合的一種技術。首先是將樣本中的HCV重組抗原包被的順磁微粒子和項目稀釋液混合，使得樣本中的HCV抗體HCV包被的微粒子上；然后進行沖洗，加入吖啶酯標記的結合物，再次進行沖洗并向反應混合物中加入預激發液和激發液。最后通過反應中的發光信號的化學發光反應進行測量HCV抗體的含量，從而獲得樣本中HCV抗體的含量。樣品中HCV抗體的含量和雅培全自動化學發光免疫分析儀（型號ARCHITECT i2000）光學系統檢測到的RLUs值成正比。該方法操作快速、簡單、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子結合不會減小所產生的光量，從而增加靈敏度。

化學發光法擁有靈敏度高、特異性高、沒有放射性等優點，但同時存在較高的假陽性率，可能是檢測時存在其他抗體的干擾，比如類風濕類抗體；或者標本狀態的影響，比如標本乳糜、嚴重溶血、纖維蛋白原較多等。李峰[28]通過i2000化學發光分析儀檢測22849例血清標本，陽性率為0．57%，假陽性率為16．03%，假陽性率較高，對檢驗人員的操作要求更嚴格、更規范，還需相關資料進行綜合判定考慮。王正芳[29]研究抗HCV用化學發光標記免疫分析法（CLIA）法檢測S/CO值時，重組免疫印跡法（RIBA）確證的陽性率隨著S/CO值的增加顯著升高。

3．3 膠體金法快速試驗 膠體金法快速試驗包括免疫層析和免疫滲濾試驗。免疫層析試驗：其原理是以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質控線必須顯色。免疫滲濾試驗：斑點免疫膠體金快速試驗是以硝酸纖維薄膜為載體，HCV抗原點狀固定在膜上，加待測檢樣品。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10min以內。有效試驗的質控點必須顯色[30]。

金標法快檢的假陰性造成的因素可能是判斷結果時間不夠、反應不充分、氣溫低、加血量過多或過少；過濾膜破損造成血液滲出濾膜使檢測線模糊，判斷失誤；判定經驗不足，將隱約可見的陽性線判斷為陰性，或將強陽性判斷為陰性等。而假陽性率較低，說明陽性符合率較高，考慮因素可能是試劑因素[31]。

3．4 熒光定量PCR法 PCR法是目前檢測病毒核酸病毒最靈敏的一種直接檢測方法，可用于HCV感染早期病毒量很低時就能檢測出HCV RNA存在[32]。其原理是以HCV基因編碼區的高度保守區為靶區域，設計特異性引物及熒光探針，進行一步法RT-PCR擴增，用于血清或血漿樣本中HCV RNA的定量檢測。HCV RNA陽性及其病毒量的多少證明有病毒存在并提示其復制活躍程度和傳染性的強弱。動態觀察HCV RNA與抗HCV的變化，可為丙肝預后判斷和用藥療效提供依據和評價指標。熒光定量PCR與高敏化學發光法（CIA）相比，二者均可能產生假陽性，但PCR檢測結果假陽性率低于CIA[33]。

4 小結

HCV在我國具有較高的發病率，經輸血或血制品傳播可能是HCV感染的一個重要途徑[34]。HCV具有很強的隱匿性，大多數患者由于在最初感染的時候癥狀不明顯因而沒有發現，從而錯過了早發現早治療的最佳時機[35]。一般情況下，患者5年以內的治愈率高達70%～90%，而5～10年的治愈率55%～75%左右，如10年以上的患者治愈會明顯下降[36]。就檢測方法而言，化學發光微粒子免疫分析（CMIA）、ELISA、膠體金快速試驗和熒光定量PCR法檢測HCV-RNA等檢測方法都各具有局限性，因此可以通過比較它們的優缺點，選用兩種或多種方法進行聯合檢測來縮短窗口期的診斷方法，降低假陰性率、漏檢率，從而達到對初期HCV感染患者進行早診斷、早治療的臨床目標。