聯合檢測血清Myo、cTn I、GDF-15及miRNA-499對AMI的診斷價值

潘廣杰

(鄭州大學附屬洛陽中心醫院心內科，河南 洛陽 471009)

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病情進展，能夠導致患者惡性心血管結局事件的發生，增加患者的病死率。流行病學研究顯示，AMI的發病率可達334～566/10萬人左右[1]。AMI的早期診斷具有重要的意義，能夠指導臨床上早期的溶栓或者介入等治療。但現階段臨床上包括心肌肌鈣蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）、肌紅蛋白（myoglobin，Myo）等心肌酶譜蛋白，在 AMI的診斷過程中雖然具有一定的參考價值，但其診斷的靈敏度或者特異度仍然不夠理想。血清生長分化因子-15 （growth differentiation factor-15，GDF-15）能夠通過誘導下游趨化因子的激活，促進心肌細胞的損傷及壞死[2，3]； 微小RNA-499 （miRNA-499）能夠通過調控缺血條件下的心肌細胞的凋亡程度，從而參與到AMI的病情進展過程中[4，5]。為了進一步揭示血清 Myo、cTn I、GDF-15及 miRNA-499的異常表達與AMI的病情關系，為臨床上AMI的診斷提供血清學參考，本次研究選擇了相關AMI、 不穩定型心絞痛 （unstable angina pectoris，UAP）、穩定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）等，探討了相關指標的表達及其診斷學價值。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2014年4月至2016年8月期間我院確診的AMI患者80例 （AMI組）、80例不穩定型心絞痛患者（UAP組）、穩定型心絞痛患者80例（SAP組）、選取80例健康體檢對象作為對照組。

AMI組，男 50例、女 30例，年齡 44～79 歲，平均 56．4±11．6 歲，體質量指數（BMI）22．9±2．1kg/m2，合并高血壓38例、糖尿病17例、高血脂29例。UAP組，男 46例、女 34例，年齡 46～79歲，平均58．0±10．2 歲，BMI 22．5±2．3kg/m2， 合并高血壓 41例、糖尿病14例、高血脂32例。SAP組，男47例、女 33 例， 年齡 41～79 歲， 平均 55．8±12．0 歲，BMI 23．2±2．5kg/m2，合并高血壓 34 例、糖尿病 20 例、高血脂27例。對照組，男48例、女32例，年齡44～79歲，平均 57．2±12．0 歲，BMI 23．1±2．4kg/m2。 四組研究對象的年齡、性別、BMI比較，差異均無統計學意義（P＞0．05）；AMI組、UAP 組及 SAP 組患者的合并疾病情況差異無統計學意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標準

1．2．1 納入標準 ⑴AMI、UAP、SAP 三組患者的診斷依據中華醫學會心血管病分會制定的診斷標準[5]；⑵患者年齡范圍18～79歲；⑶患者經冠脈造影檢測，至少發現一支冠狀動脈的狹窄程度＞50%；⑷對照組來源于本院體檢中心的健康自愿者；⑸本研究獲得研究對象的知情同意。

1．2．2 排除標準 ⑴伴有全身感染性疾病；⑵惡性腫瘤；⑶血液系統疾病；⑷心臟瓣膜疾病、嚴重的心律失常、心力衰竭；⑸長期應用免疫抑制劑、激素類藥物。

1．3 指標檢測方法 清晨采集空腹靜脈血，-20℃保存待測，采集標本后1周內檢測GDF-15、cTnI、Myo。采用電化學發光全自動免疫分析儀(美國雅培i2000)及試劑盒，檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術有限公司。

miRNA-499的檢測：采集患者靜脈血2ml，按照2000r/min的離心速度進行離心分離血清，逆轉錄成cDNA后，采用RT-PCR檢測miRNA-499濃度，底物中加入上游引物0．5uM、下游引物0．5uM，RT-PCR反應混合液5ul，dNTP稀釋至20ul，反應條件：95℃3min、95℃15s、90℃5s， 一共 40 個循環，產物擴增長度為134bp。miRNA-499引物序列：上游 引 物 （F）：5’CATGGGTTGTGTCAGTGTCAGAGCT-3’ 下 游 引 物 （R）：5’．丁 GCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3’。

miRNA-499相對量的計算：采用GenEx軟件分析方法來進行miRNA相對定量分析。GenEx軟件可通過 http：www．qpcrforum．com 下載，將目的基因和內參基因的擴增效率輸入軟件中，根據軟件的相關說明進行操作。

2 結果

2．1 四 組 研 究 對 象 的 血 清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較 AMI組患者的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平均顯著的高于 UAP組、SAP組和對照組，差異具有統計學意義 （P＜0．05）；UAP 組、SAP 組患者的血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平均顯著的高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0．05）；見表 1。

表1 四組研究對象的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平比較

表1 四組研究對象的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平比較

注：與 AMI組比較 aP＜0．05，與對照組比較 bP＜0．05。

GDF-15（g/L）cTnI（μg/L）Myo（ng/ml）miRNA-499（相對表達量）3．14±1．77 1．62±0．83ab 1．55±0．69ab 0．48±0．14a 41．284＜0．001 3．50±1．30 1．44±0．54ab 1．28±0．57ab 0．32±0．12a 63．381＜0．001 165．9±42．3105．8±28．9ab 98．5±26．4ab 68．3±17．4a 29．462＜0．001 3．39±1．70 1．50±0．74ab 1．39±0．67ab 0．89±0．41a 35．667＜0．001組別 n AMI組UAP組SAP組對照組F值P值80 80 80 80

2．2 AMI 患者治療前后血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較 治療后AMI組患者的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平均較本組治療前顯著的降低 P＜0．05）；見表 2。

表2 治療前后AMI患者GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較

表2 治療前后AMI患者GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較

GDF-15（g/L）cTnI（μg/L）Myo（ng/ml）miRNA-499（相對表達量）3．14±1．77 1．33±0．69 8．522＜0．001 3．50±1．50 1．42±0．61 11．489＜0．001 165．9±42．394．7±22．1 13．344＜0．001 3．39±1．70 1．14±0．56 11．244＜0．001時間 n治療前治療后4周t值P值80 80

2．3 診斷價值評估 通過檢測血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平對于鑒別診斷AMI均具有一定的臨床價值，見表3和圖1；血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平聯合檢測用于鑒別診斷AMI的靈敏度為96．42%、特異度為91．75%、漏診率為 3．58%、誤診率為 8．52%、AUC 值為 0．933。

3 討論

心肌梗死的發生，一方面主要考慮與長期的心血管內皮細胞損傷導致的繼發性粥樣硬化斑塊形成有關，另一方面考慮與心血管內皮功能紊亂導致的血管相對性狹窄有關[6]。心肌梗死的患者的致殘率或者致死率可達25%以上，且心室壁破裂、腦血栓等惡性臨床結局事件的發生率可明顯上升[7]。而通過對心肌梗死發病過程中相關生物學機制的研究，可以為臨床上揭示心肌梗死的臨床預后評估提供潛在的血清學參考指標，提高AMI的早期診斷水平，改善臨床預后。

表3 各項指標單獨及聯合應用診斷AMI的臨床價值

圖1 各項指標單獨及聯合應用診斷AMI的ROC曲線圖

過度釋放的GDF-15能夠促進血管內皮細胞的氧化損傷，促進單核細胞或者巨噬細胞等對于內皮下組織的浸潤，加劇血管的狹窄。GDF-15還能夠參與心肌細胞的脂肪代謝，參與心肌細胞不飽和脂肪酸的合成。AMI患者體內由于心肌細胞膜完整性的破壞，GDF-15顯著釋放入血，體內上升的GDF-15又可以誘導下游IL-6或者IL-10，導致粥樣斑塊的形成，促進了部分血管壁的脆性改變[8，9]；Myo、cTn I是重要的心肌酶譜，其表達濃度在AMI發生3～6h內即可顯著上升，對于心肌細胞膜的損傷具有一定的標志作用，心肌細胞損傷的早期即可出現外周血中相關指標的顯著改變，但其單獨診斷AMI的靈敏度較低，可靠性不足[10，11]；miRNA-499 不僅參與到惡性腫瘤、 自身免疫性疾病等的發生過程，同時能夠影響冠狀動脈內皮細胞的凋亡，促進局部血栓形成，增加心肌細胞的缺血程度，參與到AMI的病情進展過程[12，13]。部分研究已經揭示了Myo、cTn I等常規心肌酶譜指標在AMI中的異常表達情況，但對于GDF-15等的分析不足。

本次研究通過相關指標的檢測分析可見，GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 等指標在 AMI血清中均存在顯著的高表達趨勢，其表達濃度明顯高于SAP或者UAP患者，差異具有統計學意義，同 時 在 心 絞 痛 患 者 血 清 中 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499等的表達也明顯上升，高于正常人群，這些均提示了相關因子均參與到了冠狀動脈性心臟病的病情進展過程中，從機制上考慮，相關指標對于心血管病的影響可能與下列幾個方面的因素有關：⑴GDF-15的高表達，能夠促進單核細胞或者巨噬細胞對于心肌細胞的浸潤，增加心肌細胞膜完整性的破壞；⑵在心肌梗死的病程中，由于缺血再灌注損傷的發生，miRNA-499的表達也可明顯上升；⑶cTnI、Myo的表達上升則與心肌細胞膜完整性的破壞導致的細胞內的相關心肌酶譜的釋放有關。渠樂等[14]研究者在探討了63例樣本量的AMI患者的血清學資料改變，發現cTnI、Myo可平均上升25%、30%以上，同時患者的病死率越高，治療后的惡性心血管結局事件的發生風險越高，cT-nI、Myo等的表達上升幅度越為明顯。同時相關對癥治療后，如溶栓、介入或者抗凝等治療，AMI患者的血清中相關生物學分子均明顯下降，趨勢逐漸回落，進一步提示了 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499等指標與AMI患者的病情關系，這主要與治療過程中損傷心肌細胞膜的修復、壞死心肌細胞的吸收等作用有關[15]。任何單一指標診斷AMI的靈敏度或者特異度等指標均不理想，其均存在不同程度的漏診或者誤診的發生，而通過聯合GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 等進行聯合診斷后，AMI的診斷靈敏度或者特異度均可達90%以上，臨床參考價值較為可靠。

綜上所述， 血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平在AMI中異常高表達，而聯合檢測對于鑒別診斷AMI具有較好的臨床參考價值。