GM試驗及G試驗對于深部真菌感染的診斷價值

白云雪 ，胡雪飛 ，萬臘根 ，趙銳

(1．南昌大學醫學院；2．南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

近20年來，由于器官移植、介入和手術的開展，各種免疫抑制劑、廣譜抗生素、類固醇類激素的大量應用，艾滋病、血液系統疾病、糖尿病等發病率的升高，臨床上深部真菌感染（deep fungal infection，DFI）的發病率明顯上升，在醫院感染中占重要地位[1，2]。國內流行病學研究[3]顯示目前侵襲性念珠菌感染在危重病人中死亡率約為35%～80%，曲霉菌感染死亡率高達39%～100%。大量文獻表明，DFI的預后很大程度上取決于早期的診斷和治療，然而傳統的真菌培養、組織病理學等檢查取材困難、耗時長、標本易污染、陽性率低、難以滿足現今臨床需求，因此真菌血清抗原檢測成為目前判斷早期感染的重要檢查手段[4，5]。本研究回顧性分析了2016年8月-2018年8月在我院擬診為DFI患者的相關指標，同時設立對照組，以評價G試驗及GM試驗對DFI的診斷價值。

1 材料與方法

1．1 研究對象 收集南昌大學第一附屬醫院2016年8月-2018年8月擬診為DFI并行G試驗及GM試驗的66位患者為觀察對象，排除兩試驗均陰性及臨床資料不全者。診斷標準參照我國侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則 （草案），血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)[6，7]，將患者分為確診組、臨床診斷組及擬診組。其中男性43例，年齡18～85歲，女性23例，年齡43～91歲，分別來自血液科（29例）、呼吸科（24 例）、ICU（4 例）、傳染科（3 例）、腎內科（2例）、風濕科、心內科、神經內科、腫瘤科各1例。同時納入50例非DFI的患者為對照組，其中男33例，年齡 14～78 歲，女 17 例，年齡 15～70 歲，分別來自康復科，神經外科等。采集所有患者全血或血清進行檢測。

1．2 設備與儀器 ELx808IU微生物檢測儀 （美國BioTek公司），Microfuge 20R離心機 （美國Beckman Coulter公司），智能恒溫儀。曲霉菌抗原檢測試劑盒（酶聯免疫法），真菌葡聚糖檢測試劑盒（動態濁度法）。

1．3 方法

1．3．1 GM試驗 全血標本均于 2h內離心。 取300μl血清與100μl樣本處理液混勻后于100℃水浴箱加熱3min，10000g離心10min后取上清液備檢。取50μl上清液與50μl結合物于37℃密封孵育90±5min。用800μL工作洗液洗板5次，加入200μl顯色液，室溫（+18～25℃）避光孵育 30±5min，后加入100μl終止液，混勻后30min于波長450nm讀數。

1．3．2 G 試驗 全血標本于 2h內離心，取 100μl血清加于900μl樣本處理液中，混勻后70℃保溫10min，立即放冰水冷卻備檢。取200μl待檢液加入鱟試劑中，溶解后取100μl至檢測儀檢測。

1．4 結果判讀 GM試驗以≥0．5為陽性界值；G試驗以＞10pg/ml為陽性界值。

1．5 統計學分析 應用SPSS 19．0軟件進行統計學分析，GM試驗及G試驗檢測結果用中位數 （四分位數）[M(P25，P75)]表示，計量資料 Wilcoxon 秩和檢驗。分別計算敏感度、特異度、PPV、NPV、假陽性率、假陰性率以分析診斷效能，并繪制受試者工作特征曲線 (ROC曲線)。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 合并基礎疾病 66例DFI患者中AML患者發病率最高，共11例（16．7%），其他惡性血液病20例（30．3%）；呼 吸 系 統 疾 病 21 例 （31．8%），其 中COPD患者發病率最高 （6例，9%）；2型糖尿病患者3例（4．5%）；其余患者為腎病、消化系統疾病、風濕系統疾病等共 11 例（16．7）。

2．2 病原菌分析 根據試驗組患者痰檢真菌培養及鑒定結果，共分離出白念珠菌16株（69．6%），熱帶念珠菌及光滑念珠菌各1株（8．6%），曲霉4株（17．4%），其中一位患者同時檢出曲霉及白念珠菌。

2．3 兩組患者 GM試驗、G試驗檢測結果比較DFI患者 GM 試驗檢測結果為 0．62(0．40，1．28)，高于 對 照 組 0．29(0．20，0．42)，G 試 驗 結 果 為 10．34(5．00，20．71)，高于對照組 5．00(5．00，5．00)，差異均有統計學意義（Z=-5．9081，P=0；Z=-5．646，P=0）。

2．4 GM試驗及G試驗對DFI的診斷評價 按診斷標準[6，7]及結果判讀標準，以確診及臨床診斷患者為真陽性，對照組為真陰性，計算GM試驗敏感度 為 80．8%， 特異 度 為 82%，PPV為 70%，NPV89．1%，假陽性率 18%，假陰性率 19．2%；G 試驗敏感度為 42．3%， 特異度為 98%，PPV91．7%，NPV76．6%，假陽性率 2%，假陰性率 57．7%；聯合診斷 敏 感 度 100%， 特 異 度 82%，PPV74．3%，NPV100%，假陽性率18%，假陰性率0。

2．5 ROC曲線分析 以確診+臨床診斷為金標準做ROC 曲線，GM 試驗診 DFI的 AUC 為 0．901，95%CI 0．833～0．968，最佳 Cut off值為 0．455，其敏感度為84．6%，特異度為72%；G試驗診DPFI的AUC為 0．731，95%CI 0．599～0．863， 最佳 Cut off值為10．97855，其敏感度為 38．5%，特異度為 98%。 兩者聯合檢測的 AUC 為 0．95，95%CI 0．906～0．994。 見圖1。

圖1 GM試驗、G試驗及聯合檢測的ROC曲線

3 討論

深部真菌感染是指真菌侵入內臟，血液等深部組織所致單一器官及多個組織的感染，起病隱匿、臨床表現無明顯特異性，導致漏診率高，預后兇險[5，6]。半乳甘露聚糖是曲霉菌細胞壁的組成成分，真菌侵入深部組織后引發相關免疫反應，后被巨噬細胞吞噬，釋放其入血。（1，3）-β-D葡聚糖廣泛存在于除毛霉菌，隱球菌以外的真菌細胞壁上，在細菌、病毒上均無表達，二者在感染早期即升高，并在病程全程均有含量變化[8]。根據診斷標準，DFI需依靠病理結果才能確診，但深部真菌感染患者多存在不同程度免疫缺陷，病理活檢難以施行，因此兩試驗可作為真菌感染的重要的輔助診斷，并可監測疾病預后及發展[9，10]。

近年來，DFI的發病率逐漸上升，本研究中AML患者發病率最高，這與國外相關薈萃[11]一致，原因可能與血液病患者的免疫缺陷、基礎疾病未完全控制、化療導致肝腎功能損害等有關。關于病原菌分布，雖然侵襲性曲霉菌感染的發病率逐年上升，但目前研究[3，12]表明念珠菌感染仍占較大比例，這與本文結果一致。根據結果判讀標準，試驗組GM及G試驗的結果均高于對照組，差異有統計學意義。表明兩試驗均對DFI有較大診斷價值。本研究GM試驗的敏感度為80．8%，高于國內薈萃分析[10]（65%），可能與使用 β-內酰胺類抗生素、食物污染、食用某些葡萄糖酸鹽制劑等導致假陽性有關。G試驗敏感度為42．3%，低于目前研究[9]（74%），產生差異可能與樣本來源、試劑、儀器不同所致的假陽性、假陰性有關[13]。本研究將兩種檢測方法聯合診斷，得出敏感度達100%，特異度82%，陽性預測值及陰性預測值均較高，與馮潛[14]、張海濤[15]等人的研究基本一致，這表明兩試驗同時檢測可彌補相互假陽性及假陰性，其結果均陽性高度提示DFI。本研究通過ROC曲線分析GM試驗診斷DFI的AUC為0．821，最佳Cut off值為 0．495；G 試驗 AUC 為 0．764， 最佳 Cut off值為9．4125，與現有標準基本一致。

綜上所述，真菌血清學試驗（1，3）-β-D 葡聚糖（G）試驗及半乳甘露聚糖（GM）試驗對深部真菌感染有較大診斷價值，但兩試驗均存在一定程度的假陽性與假陰性，聯合診斷能提高診斷準確性，減少漏診率。