外周血T淋巴細胞活化狀態在9種病原體感染急性期患兒的變化

李晶，林珊，陳美光

(福建省福州兒童醫院檢驗科，福建 福州 350005)

EB 病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、肺炎支原體(MP)、柯薩奇病毒(COX)、單純皰疹病毒（HSV)、風疹病毒（RV）、乙型流感病毒、副流感病毒、腸道EV71病毒是兒童常見感染性疾病的病原體，患兒在受到病原體刺激后，體內免疫系統被激活[1]，研究患兒免疫系統活化狀態特別是T細胞活化狀態對疾病的診療具有重要價值。本文采用流式細胞術檢測分析該9種病原體感染急性期患兒T淋巴細胞部分活化指標的變化，現報告如下。

1 對象與方法

1．1 研究對象 收集2016年1月-2017年10月我院收治的9種病原體感染患兒共186例，男106例，女80例，年齡6月～13歲。其中EBV病毒感染(EB-VCAIgM且EBV-DNA陽性)患兒23例，巨細胞病毒感染 (CMV-IgM且CMV-DNA陽性)21例、肺炎支原體感染(MP-IgM且MP-DNA陽性)53例、柯薩奇病毒感染(COX A16-IgM陽性)13例，單純皰疹病毒感染（HSV-IgM陽性）25例，風疹病毒感染（RV-IgM陽性）9例，乙型流感病毒感染（乙型流感病毒-IgM陽性）12例，副流感病毒感染（副流感病毒1、2、3型-IgM陽性）16例， 腸道 EV71感染（HEV71-IgM陽性）14例；混合感染患兒51例，其中13例EBV感染，25例CMV感染，43例MP感染。對照組[2]選取在福建省福州地區進行健康體檢或術前查體（均為對免疫功能影響不大的疾病）的健康兒童，均符合以下標準：外周血細胞計數、肝腎功能、X線檢查均正常，無明顯的心、腦血管疾病，無先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾病，近期無感染性疾病，近期未使用過影響免疫系統的藥物，年齡為2個月～16歲共400例，其中男208例，女192例。均采集外周靜脈血2ml于肝素鈉抗凝管，顛倒混勻，不能及時檢測標本置4℃冰箱保存，不超過24h。

1．2 病原學測定方法 應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測患兒血清中EB病毒抗衣殼抗體IgM（EB-VAC IgM）、MP-IgM、 巨細胞病毒 CMV-IgM抗體、單純皰疹病毒I型IgM抗體，風疹病毒抗體IgM、COX-IgM或應用熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測兒童咽拭子 EBV-DNA、MP-DNA及CMV-DNA。應用膠體金法檢測腸道病毒71型IgM抗體及柯薩奇病毒A16型IgM抗體，應用間接免疫熒光法檢測呼吸道感染病原體甲型流感病毒IgM抗體，乙型流感病毒IgM抗體、副流感病毒1、2、3型IgM抗體。

1．3 流式細胞術檢測方法 ①儀器 美國BD公司的FACSCalibur型流式細胞儀。

②試劑采用美國BD公司的淋巴細胞亞群活化分析試劑，熒光標記4色單克隆抗體，CD4-FITC/CD38-PE/CD3-PerCP/Anti-HLA-DR-APC，CD8-FITC/CD38-PE/CD3-PerCP/Anti-HLA-DRAPC、使用配套的溶血劑(FACS Lysing Solution)，熒光校正微球 （CaliBRITEBeads） 分別為：Unlabeled Beads、APC Beads、FITC Beads、PE Beads、PerCP Beads。

③標本制備：按照試劑使用說明書的要求，每份樣本分別加入20μl單抗試劑于流式細胞儀專用TruCONT管中，加入50μl EDTA抗凝全血，混勻在室溫暗處放置15min，加入450μl 10%FACS溶血素，混勻在室溫暗處放置15min，上機獲取標本數據。

④儀器校正 本研究上機前使用BD公司專用的熒光校正微球對流式細胞儀進行校正，包括光電倍增管電壓的調節、熒光補償的調節，以及靈敏度的測試等，使流式細胞儀處于最佳的運行狀態。

⑤結果分析應用CellQUEST軟件測定淋巴細胞表面抗原 CD3+及活化指標 CD4+CD38+、CD4+Anti-HLA-DR+，CD8+CD38+、CD8+Anti-HLA-DR+的百分率和絕對計數并分析結果。

⑥質量控制：數據均由同一技術人員在同一標準下進行讀取，數據的取舍和分析則由本文2名作者共同完成。

1．4 統計學分析 采用SPSS 19．0軟件進行統計學分析，檢測結果用均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數差異比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

與正常兒童比較，CMV、MP、COX、RV、 腸道EV71及副流感病毒急性感染期CD3+細胞百分比顯著減低，差異有統計學意義（P＜0．01）。 其中腸道EV71 CD3+絕對計數減低，差異有統計學意義（P＜0．05）， 副流感病毒 CD3+絕對計數顯著減低 （P＜0．01），而 EBV CD3+絕對計數顯著增高（P＜0．01）。EBV、CMV、MP、COX、腸道 EV71 及混合感染急性期CD4+CD38+細胞百分比顯著減低，差異有統計學意義（P＜0．01），其中 MP、COX、EV71 感染及混合感染 CD4+CD38+的絕對計數顯著減低 （P＜0．01）。EBV、CMV、風疹病毒（RV）、乙型流感病毒及混合感染急性期CD4+HLA-DR+百分比和絕對計數均增高，差異有統計學意義（P＜0．05），單純皰疹病毒（HSV)感染時CD4+HLA-DR+絕對計數增高 （P＜0．05）； 而腸道 ev71 病毒感染時 CD4+HLA-DR+百分比和絕對計數均顯著減低（P＜0．01），柯薩奇病毒(COX)感染時CD4+HLA-DR+絕對計數顯著減低（P＜0．01）。 CD8+CD38+百分比和絕對計數在 EB 病毒(EBv)、巨細胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒（HSV)、風疹病毒 （RV)、副流感病毒感染時均增高 （P＜0．05），尤其在 EB 病毒(EBv)、巨細胞病毒(CMV)感染時顯著增高（P＜0．01），CD8+CD38+百分比在柯薩奇病毒(COX)、乙型流感病毒感染時增高（P＜0．05），CD8+CD38+絕對計數在腸道ev71病毒感染時顯著減低（P＜0．01）。 CD8+HLA-DR+百分比和絕對計數在巨細胞病毒(CMV)、乙型流感病毒及副流感病毒感染時增高（P＜0．05），其百分比在風疹病毒（RV）感染時增高 （P＜0．05），其絕對計數在EB病毒(EBv)、單純皰疹病毒（HSV）及混合感染時增高（P＜0．05）。9種病原體感染后患兒急性期淋巴細胞活化的表達，見表1。

3 討論

大量的研究表明[3-6]，病原體感染與T細胞抗原識別(antigen recognition)和活化(activation)異常相關。T細胞的活化可以直接影響整個免疫應答的性質、效能和結果，在人體免疫反應中具有核心作用。T細胞是識別和擊退入侵機體的病毒和細菌的白細胞，當T細胞遭遇這些外來入侵者時，它們就會通過一個活化過程自身迅速增殖數千倍，在免疫系統應答中扮演著重要角色[7]。

表1 9種病原體感染后患兒急性期淋巴細胞活化結果（

表1 9種病原體感染后患兒急性期淋巴細胞活化結果（

注：各疾病組與健康對照組相比 * 表示 P＜0．01；# 表示 P＜0．05。

CD3+百分比（%）絕對計數(個/μl)CD4+CD38+百分比（%）絕對計數(個/μl)CD4+HLA-DR+百分比（%）絕對計數(個/μl)CD8+CD38+百分比（%）絕對計數(個/μl)CD8+HLA-DR+百分比（%）絕對計數(個/μl)87．0±3．6 5536±424*62．0±14．0*3226±1472 63．8±11．7*2641±1406#51．0±9．5*1723±768 65．6±12．9 3087±1546 53．0±8．0*2429±1751 60．0±12．0*2492±1085 63．0±12．0#2590±1503 58．3±9．2*1887±912*64．0±13．0 3155±1407 67．4±7．4 3053±1428 20．2±14．0*1229±990 28．0±4．1*1717±1170 26．1±13．2*1037±833*21．8±11．9*494±271*31．7±16．9 1878±1146 31．9±9．4 1810±1122 29．0±9．0 1037±124 26．2±4．9 912±53 21．6±6．5*471±293*21．9±10．9*1116±926*31．3±12．5 1506±1088 2．9±1．4#318±411#3．5±2．7#300±384#2．5±2．2 124±194 2．3±1．9 51±37*3．1±2．3231±268#7．5±7．2#433±367*5．6±1．8*214±107*4．4±3．5 173±164 1．8±0．4*35±12*4．1±3．9*237±266*2．3±1．16 101±80 25．4±5．6*2071±1968*30．5±7．2*2115±2040*20．3±7．4 955±1118 33．6±15．7*722±363 21．8±7．9#1543±1242*29．8±8．1*2063±2080#33．2±24．2#1339±1081 36．6±18．0*1407±985#22．3±8．7 466±245*20．5±11．3 1279±1495#18．3±6．0 828±528 5．07±4．73 1166±1897#16．9±13．9*1439±1862*4．4±5．2 339±800 8．1±6．3 175±156 7．4±9．6 707±1170#16．1±15．2#1385±1907 19．5±22．4#815±980#19．8±22．0*818±977#5．4±3．3 101±59 8．1±10．2 671±1117*4．9±3．5 208±200組別 例數EB病毒(EBv)巨細胞病毒(CMV)肺炎支原體(MP)柯薩奇病毒(COX)單純皰疹病毒（HSV)風疹病毒（RV）乙型流感病毒副流感病毒腸道ev71病毒混合感染對照組23 21 53 13 25 9 12 16 14 51 400

病原體感染對宿主免疫細胞應答、免疫細胞間的相互作用、細胞因子與抗體應答均有影響。病毒感染后可以在體內長期潛伏，在一定條件下可以活化并可轉化淋巴細胞，而病毒感染后宿主細胞免疫功能對控制病毒感染和清除病毒起到關鍵作用。我們選擇了病原體感染急性期患兒，與正常對照組進行比較，了解病原體感染患者的淋巴細胞活化變化情況，以探討病原體感染與宿主細胞免疫功能的相互關系[8-11]。

本結果顯示，與正常對照組相比，除EB病毒感染CD3+絕對計數增高，HSV、混合感染無明顯改變外，其余多數病毒感染CD3+百分數明顯下降。CD3+細胞是成熟T淋巴細胞的特異性標志，反映了T淋巴細胞活化的比例[12]。病毒感染后機體產生有效的免疫應答，既是清除感染病毒的重要保護措施，也可能伴隨對組織器官的免疫損傷。淋巴細胞活化是免疫應答的重要過程[13]。CD3+淋巴細胞較對照組明顯下降，提示T淋巴細胞活化功能被抑制，可能導致機體免疫功能降低。

CD38+分子介導激活信號，參與T細胞的激活[14]。HLA-DR是MHC-1I類分子，具有高度多肽性，在調控抗原遞呈細胞激活T細胞活化程度和特異性中起重要作用，是T細胞活化晚期表達抗原[15]。檢測HLA-DR和CD38分子在T淋巴細胞表面的表達情況能反映細胞的活化狀態和程度，作為評價患者病情、診療效果和患者免疫功能恢復的指標[16]。EBV、CMV、MP、COX、腸道 EV71 及混合感染急性期CD4+CD38+細胞百分比明顯降低，其中MP、COX、腸道 EV71及混合感染 CD4+CD38+絕對計也明顯降低，說明病毒感染使T細胞的活化受到抑制，同時機體的免疫應答也受到一定抑制。而CMV、RV及乙型流感病毒感染時，CD4+HLADR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+百分數與絕對計均明顯增高。EB、HSV感染時，CD4+HLA-DR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+絕對計數及 CD8+CD38+百分數明顯增高。副流感病毒感染時CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+百分數與絕對計明顯增高，混 合 感 染 時 CD4+HLA-DR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+絕對計數及CD4+HLA-DR+百分數明顯增高。HLA-DR穩定表達在淋巴細胞活化晚期，此時患者細胞免疫明顯被激活，使機體細胞免疫功能亢進，細胞百分比及絕對計數升高顯示病毒感染后細胞免疫對控制病毒感染和清除病毒起到積極作用。然而引起兒童手足口病最為常見的腸道病毒 EV71 CD4+CD38+、CD4+HLA-DR+百分數與絕對計數及CD8+CD38+絕對計數明顯降低，與國內孫林春[17]報道結果有異，T細胞活化標記的表達明顯降低，顯示T細胞的活化受到抑制，可能導致患兒處于免疫功能低下狀態。

本結果證明了，9種病原體感染后患兒體內呈免疫活化和失衡狀態，病毒使機體免疫細胞異常激活或發生功能缺陷。不同病原感染后，患兒T細胞免疫改變各具特點，因其中幾種病原體感染在臨床癥狀上具有一定的相似性，檢測患兒活化T淋巴細胞亞群可作為一種鑒別和監測手段，為臨床鑒別病原體感染和掌握患兒病情提供重要參考依據．