玉米赤霉酮純度標準物質雜質定性鑒定與主成分定量分析

馮夢雨,劉 栓,2,高 燕,周澍堃,國 振,李秀琴*,張慶合

(1.中國計量科學研究院,北京 100029;2.北京化工大學,北京 100029)

玉米赤霉酮(zearalanone,ZAN)為玉米赤霉烯酮經過多次轉化得到的降解產物,是一種白色結晶,CAS號為5975-78-0,化合物的結構式見圖1。玉米赤霉酮具有弱雌激素效應,通過食物鏈進入人體后,可引起人體功能發生紊亂,甚至影響生育[1,2]。目前國內外還沒有玉米赤霉酮的限量標準,國家標準方法[3-6]中規定，測定動物源食品(牛豬肝腎、肌肉組織、牛奶和雞蛋等)和水產品(河豚、鰻魚、烤鰻)中玉米赤霉酮殘留量均采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)。目前已建立了各種分析玉米赤霉酮的方法,包括高效液相色譜法(HPLC)[7]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[8,14]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[9]和液相色譜-串聯質譜法[10-12]。質譜儀器因其高靈敏度和準確性已經越來越多的應用于玉米赤霉酮等的研究。Li等[13]改進了一種基于UPLC-MS/MS的96孔微洗脫固相萃取方法,并運用這種方法對玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮及其他代謝產物進行了高通量及高靈敏度的測定。Qian等[14]開發了凝膠滲透色譜法和氣相色譜-三重四極桿質譜法(GC-QqQ MS)同時測定食用植物油中的玉米赤霉酮等。采用雙波長熒光偏振免疫分析(DWFPIA)[15]檢測玉米中總黃曲霉毒素和玉米赤霉酮,用不同的熒光素標記黃曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉酮,通過結合特異性抗體，開發DWFPIA方法篩選天然污染的樣品,取得了和HPLC-MS/MS相似的結果。然而目前國內外還沒有玉米赤霉酮純度標準物質,在國際標準物質數據庫(COMAR)和國家標準物質資源共享平臺均未查到玉米赤霉酮標準物質及其溶液標準物質的相關信息。因此開展玉米赤霉酮標準物質的研制工作是十分必要的,以保障玉米赤霉酮相關檢測結果的準確、可靠。

圖1 玉米赤霉酮的結構式Fig.1 Structural formula of zearalanone(ZAN)

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(UPLC-HRMS,美國Thermo Fisher Scientific公司);Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);ME235S(0.01 mg)、ME36S電子天平(0.001 mg)(德國Sartorius公司)。

玉米赤霉酮(純度≥99.0%)、玉米赤霉烯酮(純度≥99.5%)、α-玉米赤霉醇(純度≥97%)、β-玉米赤霉醇(純度≥98%)、α-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(104.8 mg/L)、β-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(99.3 mg/L)、7-脫氫玉米赤霉烯酮(純度≥90%)均購自天津阿爾塔科技有限公司。乙腈、甲酸(色譜純)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;水(色譜純)購自德國Merck公司。

分別取適量玉米赤霉酮樣品,配制成質量濃度為0.1 g/L和0.5 g/L的玉米赤霉酮乙腈溶液。置于-20 ℃冰箱中保存。本研究中所使用的標準溶液均采用重量法配制,乙腈為溶劑。

1.2 定性分析方法

采用紫外檢測法和質譜法對玉米赤霉酮主成分進行定性分析,并采用UPLC-DAD和高分辨質譜對ZAN原料中所含痕量雜質進行定性鑒定。

1.2.1UPLC-DAD方法

色譜柱:Phenomenex Kinetex EVO C18柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm);柱溫:27 ℃;流動相:A相為乙腈-水(40∶60,v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液,B相為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:1.5 mL/min。梯度洗脫條件:0～15 min,100%A;15～16 min,100%A～10%A;16～18 min,10%A;18～19 min,10%A～100%A;19～25 min,100%A。,進樣量:10 μL(0.5 g/L玉米赤霉酮乙腈溶液);檢測波長:264 nm。

1.2.2UPLC-HRMS方法

采用高分辨質譜的一級質譜全掃描加數據依賴的二級質譜掃描方式(Full MS/dd-MS2),分析時采用正負離子切換方式。

一級質譜參數:離子源為電噴霧電離源;掃描范圍為m/z200～800;分辨率為70 000 FWHM(一個峰半峰高處的全峰寬);自動增益控制目標離子數(AGC target)為1×106。

dd-MS2參數:分辨率為17 500 FWHM;歸一化碰撞能量(NCE)為30 eV;動態排除時間為10.0 s;AGC target為1×105。為避免污染儀器,主成分不進入質譜。

1.3 主成分定量分析

購買雜質對照品,采用已建立的UPLC-DAD方法,測量雜質的響應因子；無對照品雜質的響應因子采用其他雜質響應因子的平均值代替。最后采用響應因子校正面積歸一化法對玉米赤霉酮主成分進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 液相色譜分析條件的優化

2.1.1色譜柱的選擇

目前國內外HPLC測定真菌毒素的文獻[16-18]中,最常用的色譜柱為含C18官能團的色譜柱,主要是因為C18固定相有較高的含碳量和更好的疏水性,柱穩定性高,壽命長,平衡速度、分析速度快,重現性好,對真菌毒素具有很好的分離效果。本實驗考察了3種C18反相色譜柱,分別為色譜柱1 ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、色譜柱2 Kinetex EVO C18柱(150 mm×3.0 mm,2.6 μm)和色譜柱3 Phenomenex Kinetex EVO C18柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm)。實驗以乙腈-水(40∶60,v/v)為流動相等度洗脫20 min,結果顯示,在3種色譜柱上樣品的峰形與分離效果均較好,能分離出的雜質數目相同,各個峰的分離度均大于1.5,其中采用色譜柱3時，分離出的4個色譜峰的分離度分別為13.37、13.67和13.64,分離度最好。因此本研究選擇分離度最好的Phenomenex Kinetex EVO C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm)進行分析。

圖2 采用不同流動相時玉米赤霉酮原料的色譜圖Fig.2 Chromatograms of ZAN raw material using the different mobile phases a.mobile phase:water and acetonitrile (50∶50,v/v),isocratic elution;b.mobile phase:water (A)and acetonitrile (B),gradient elution:0～23 min,60%A;23～24 min,60%A～10%A;24～26 min,10%A;26～27 min,10%A～60%A;27～35 min,60%A;c.mobile phase:acetonitrile-water (40∶60,v/v)containing with 0.1% (v/v)formic acid (A)and acetonitrile containing with 0.1% (v/v)formic acid (B),gradient elution:0～23 min,100%A;23～24 min,100%A～10%A;24～26 min,10%A;26～27 min,10%A～100%A;27～35 min,100%A. Peaks 1-4 were the impurities 1-4..

2.1.2流動相組成

考察了不同比例的水和乙腈作為流動相進行等度洗脫和梯度洗脫時主成分與雜質的出峰情況,結果見圖2。由圖2可知,在水-乙腈(50∶50,v/v)(流動相a)條件下等度洗脫,分離出3種雜質,基線較平穩,各雜質之間及與主峰之間能基本分離,但主峰有拖尾現象(拖尾因子(T)=1.32)。在水-乙腈(60∶40,v/v)(流動相b)初始條件下梯度洗脫,僅分離出的2種雜質,各雜質之間與主峰之間均能完全分離,但所有峰均有嚴重拖尾現象,3個峰的拖尾因子分別為2.01、1.79和2.1。以乙腈-水(40∶60,v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液為A相、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液為B相(流動相c)進行梯度洗脫，可分離出4種雜質,而且峰與峰之間的分離度均大于1.5,色譜峰對稱性較好。因此,綜合考慮分離雜質數量和峰形,選擇流動相c作為最佳流動相條件。

為確證該流動相條件下能夠將原料中所有的非極性雜質完全洗脫,在最優流動相洗脫結束后,再以乙腈-水(90∶10,v/v)洗脫60 min,結果表明主成分出峰之后并無雜質被洗脫出來,因此后續不采用乙腈-水(90∶10,v/v)繼續洗脫。

2.1.3流動相流速

考察了1.0 mL/min和1.5 mL/min不同流速下玉米赤霉酮原料的分離情況。結果顯示,兩者分離出的雜質數目相同,且峰與峰之間的分離度均大于1.5。增加流速,可縮短分析時間,因此選用1.5 mL/min的流速。

2.1.4樣品濃度的選擇

考察了0.1、0.5、1.0 g/L的樣品進樣時的分離情況。結果顯示,不同的樣品濃度,分離結果沒有差別。為了節省樣品、減少污染,采用0.1 g/L樣品溶液進行定量分析,0.5 g/L樣品溶液進行定性分析。

2.1.5檢測波長的選取

對玉米赤霉酮原料在190 nm～400 nm波長下掃描,發現玉米赤霉酮的3個最大吸收波長分別為216、264和302 nm;雜質1的最大吸收波長為262 nm,雜質3的為216 nm和264 nm,雜質4的為256 nm。綜合考慮主成分和雜質的響應,選用264 nm作為檢測波長。

2.2 定性分析

2.2.1主成分定性分析

從玉米赤霉酮原料的質譜圖可得出其主成分([M-H]-)的相對分子質量為319.2,與玉米赤霉酮的相對分子質量(320.380)相符合,另外兩個特征碎片離子的m/z275.3、205.2均與文獻報道[19,20]一致。根據玉米赤霉酮的裂解規律,推測玉米赤霉酮的裂解途徑見圖3,其酯基斷裂,脫去一個CO2分子,產生離子[M-H-CO2]-,該離子進一步脫去一個C5H10分子得到[M-H-CO2-C5H10]-,兩個離子的質荷比與上述兩個特征碎片離子的質荷比一致,可以證明此樣品為玉米赤霉酮。

圖3 負離子模式下玉米赤霉酮的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of the ZAN in negative ion mode

圖4 玉米赤霉酮乙腈溶液(0.5 g/L)、乙腈、α-玉米 赤霉醇(0.1 g/L)和β-玉米赤霉醇(0.1 g/L)的典型色譜圖 Fig.4 Typical chromatograms of ZAN acetonitrilesolution(0.5 g/L),acetonitrile,α-ZAN(0.1 g/L)and β-ZAN(0.1 g/L)Peaks 1-4 were the impurities 1-4.

2.2.2雜質定性分析

采用UPLC-DAD對玉米赤霉酮原料進行分析,得到其主成分及雜質成分的典型色譜圖(見圖4)。根據面積歸一化法可知,雜質1～4的含量分別為0.018%、<0.01%、0.287%和0.19%。根據ZAN可能的代謝降解路徑,推測樣品中可能含有玉米赤霉醇、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮等。根據保留時間進行初步鑒定,雜質1為β-玉米赤霉醇,雜質3為α-玉米赤霉醇。

采用UPLC-HRMS的Full mass dd-MS2模式對ZAN原料中的3種主要雜質進行質譜鑒定。由圖5可知,雜質1母離子([M-H]-)的m/z為321.171 11與β-玉米赤霉醇母離子的m/z321.171 14一致,質譜圖也完全一致,確證該雜質為β-玉米赤霉醇;雜質3母離子([M-H]-)的m/z為321.171 20與α-玉米赤霉醇母離子的m/z321.172 03一致,質譜圖也完全一致,確證該雜質為α-玉米赤霉醇。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇為同分異構體,它們的主要質譜碎片的裂解途徑見圖6a,m/z為303.160 92的主要碎片為玉米赤霉醇7位C上的羥基與6位C上的氫作用脫去一個H2O分子,而產生的離子[M-H-H2O]-,該分子進一步脫去一個CO2產生m/z為259.170 72的離子;另一m/z為277.181 24的主要碎片為玉米赤霉醇的酯基脫去一個CO2分子產生。

由圖5可知,雜質4母離子的m/z為303.160 74,軟件推測雜質4的分子式為C18H24O4,可以得知該化合物母離子與玉米赤霉醇母離子(m/z321.171 11)的分子量相差18,推測該化合物為玉米赤霉醇的脫水降解產物,其結構為玉米赤霉醇7位羥基脫掉一個H2O分子,在6位C和7位C之間形成一個烯鍵。根據該雜質的進一步質譜碎片,推測其裂解途徑如圖6b所示,主要碎片(m/z259.170 68)為脫水玉米赤霉醇的酯基脫去一個CO2分子,該分子進一步脫去一個C2H4分子產生m/z為231.138 52的碎片,其脫去一個C2H2分子得到m/z為205.123 12的碎片離子。但是,目前無法購買到脫水玉米赤霉醇的對照品,不能進行驗證。

圖5 雜質1、3與其對照品和雜質4的二級質譜圖Fig.5 MS2 spectra of impurities1,3 and their standards,and impurity4

圖6 負離子模式下(a)雜質1、雜質3和(b)雜質4可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of(a)impurity1 or impurity3 and(b)impurity4 in negative ion mode

2.3 定量分析

2.3.1雜質響應因子的測定

2015版中國藥典[21]中規定測定雜質含量時,可采用加校正因子的主成分自身對照法,通常以主成分為參比,且需將供試品溶液稀釋作為對照溶液;雜質含量低于0.5%的峰面積的RSD應小于10%。趙敬丹等[22]比較了外標法和加校正因子的主成分自身對照法測定頭孢孟多酯鈉中的雜質,結果基本一致。因此在沒有雜質對照品的情況下,均應采用加校正因子的主成分自身對照法定量,增加測定結果的準確度,也無需持續提供雜質對照品。劉光敏[23]采用標準曲線法和加校正因子的主成分自身對照法測定非那雄胺片中2種有關物質含量,測定結果也基本一致。采用相對校正因子法適用于快速檢測,現場檢測[24]。

采用單點法測量,根據公式(1)和(2)計算雜質和主成分相應進樣量下的響應因子和相對響應因子。對于沒有對照品的雜質4，用雜質1和3兩個已知雜質響應因子的平均值作為其相對響應因子。公式(1)和(2)如下所示：

(1)

(2)

式中,fi和fm:雜質組分和主成分的響應因子,mAU×min/ng;Ai和Am:雜質組分和主成分的色譜峰面積,mAU×min;Ci和Cm:雜質組分和主成分進樣的質量濃度,g/L;Vi和Vm:雜質組分和主成分的進樣體積,μL;Fi:各雜質相對主成分的相對校正因子。

根據公式計算得到雜質1、3和主成分的響應因子分別為0.745 4、1.196 9和1.392 8 mAU×min/ng。使用主成分響應因子校正后得到雜質1和3的相對校正因子為0.535 2和0.859 4,雜質4的相對校正因子取這兩者的平均值,為0.697 3。3個雜質的相對響應因子均不在0.9～1.1之間,因此可采用“加校正因子的主成分自身對照法”計算雜質的含量[25-27]。

2.3.2主成分純度定量分析

由于儀器響應的線性限制,峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質的檢査。因此采用校正后的峰面積歸一化法來測定主成分純度,公式(3)如下所示:

(3)

式中,Po為主成分純度。

采用UPLC-DAD法測定主成分純度。稱取11份玉米赤霉酮原料約1 mg，配制成0.5 g/L的乙腈溶液，進樣分析。按公式(3)計算，采用相對校正因子校正后，雜質1的含量小于0.01%,雜質3和雜質4的含量分別為0.2%和0.1%。最終得到玉米赤霉酮主成分的純度為99.6%,標準偏差為0.01%。

3 結論

研究建立了玉米赤霉酮的純度定量以及結構類似物雜質的定性和定量分析方法。針對高純標準物質研制中微痕量雜質的定性鑒別和分析難點和關鍵點,通過采用UPLC-DAD和UPLC-HRMS技術成功鑒定了玉米赤霉酮中的3種雜質。該方法可為玉米赤霉酮標準物質的研制提供理論支持。