結構蛋白質組學研究進展

周 燁,劉哲益,王方軍*

(1.中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023;2.中國科學院大學,北京 100049)

蛋白質是生命體遺傳信息的翻譯產物和生物學功能的主要承擔者,催化和控制生物體內幾乎所有過程。蛋白質組學(proteomics)是對生命體內的全套蛋白質進行規模化系統分析的新興學科,其研究范圍不僅包括蛋白質的規?；ㄐ院投?還包括蛋白質的翻譯后修飾、相互作用、結構和功能研究。蛋白質生物學功能的實現與其空間結構密切相關,蛋白質功能的調控也主要依賴于其構象和相互作用的動態調節;對蛋白質結構和功能的研究一直是生命科學領域的研究熱點,也是當前蛋白質組學研究的重要發展方向[1,2]。

自從20世紀50年代后期第一個蛋白質結構被解析以來[3],全世界已經有46 000多個蛋白質和蛋白質復合物的結構被成功解析,極大促進了蛋白質生物學功能的闡釋和后續靶向調節試劑的設計開發。解析蛋白質結構的常規方法包括X射線晶體衍射(X-ray crystallography,XRD)技術[4]、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術[5]和冷凍電鏡(cryo-electron microscope,cryo-EM)技術[6]。XRD只能提供蛋白質的靜態結構信息;NMR雖然能夠監測蛋白質在溶液中的構象變化,但是通常只能用于30 kDa以下的蛋白質;近年來,cryo-EM發展迅速,已經成為結構生物學分析的主流方法,但是儀器設備價格較為昂貴。此外,以上3種方法對蛋白質樣品的純度和用量要求較高,樣品制備難度較大。

20世紀80年代,Tanaka[7]和Fenn[8]分別發展了基質輔助激光解吸離子化(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)和電噴霧離子化(electrospray ionization,ESI)新方法,拓展了質譜(mass spectrometry,MS)在分析肽段和蛋白質等熱不穩定、難揮發的大分子中的應用,引發了質譜分析蛋白質的革命,蛋白質組學研究進入了以質譜為核心分析平臺的新階段。質譜具有高精度、高靈敏度、高通量的特點,能夠實現對復雜蛋白質組樣品的規?；治鲨b定。目前,蛋白質組學分析方法已經被越來越多地應用于蛋白質相互作用和結構分析,其特點是不受蛋白質尺寸和純度的限制,可以進行高通量動態分析。常用的結構蛋白質組學分析方法包括基于整體活性蛋白質分析的非變性質譜分析方法和基于酶解肽段分析的限制性蛋白質酶切法、化學交聯法、氫氘交換法、共價化學標記法等方法。隨著這些新方法的不斷進步,結構蛋白質組學在近年來取得了快速發展,在蛋白質組成和構象動態變化分析、小分子藥物-蛋白質識別機制研究等方面有著越來越廣泛的應用。

本綜述將簡要概述蛋白質結構分析的經典方法,并重點討論近年來結構蛋白質組學新方法的發展和應用情況,最后對結構蛋白質組學的未來發展進行總結與展望。

1 蛋白質結構分析常規方法

1958年,歷史上第一個蛋白質結構誕生,Kendrew等[3]通過X射線晶體衍射法測定了肌紅蛋白質的晶體結構,X射線晶體衍射技術隨之成為確定原子水平蛋白質結構的經典方法。當X射線照射蛋白質時,射線被蛋白質分子中的電子散射,記錄為衍射圖案從而獲得電子密度圖,從中可分析獲得原子位置和化學鍵的信息,得到蛋白質結構。由于X射線對單個蛋白質分子的衍射能力非常弱,因此需要通過蛋白質晶體來實現探測信號的擴增,這也限制了X射線晶體衍射技術的高通量應用。蛋白質結晶通常非常耗時,需要測試多達數百個結晶條件,而且對蛋白質樣品的純度要求非常高。整合膜蛋白質、大分子復合物、無序蛋白質和多結構域蛋白質等很難得到結晶。此外,該方法僅得到蛋白質單一構象的靜態結構信息,與溶液中蛋白質的活性動態構象可能有不一致的情況。

1985年,Wüthrich等[9]首次將核磁共振技術應用于蛋白質結構測定,得到了公牛精漿的蛋白酶抑制劑IIA的結構。在NMR實驗中,需要將溶液中的蛋白質置于強磁場中,通過發送特定頻率的電磁波,使蛋白質中原子核與電磁波發生共振。核磁共振時,由于蛋白質原子所處的化學環境不同,原子核吸收的電磁波能量也不同,產生不同的共振譜信號。通過不同原子的化學位移(1H或13C),可以重建原子之間的化學聯系,從而得到蛋白質的結構信息[10]。與X射線晶體衍射相比,NMR的主要特點是分析在溶液狀態的活性蛋白質結構,可以監測不同蛋白質構象間的動態變化,是理解與蛋白質功能密切相關的構象動力學的有效手段[11]。然而,NMR需要進行蛋白質同位素標記(如15N、13C),樣品純度和用量要求較高(mmol/L級)[12],而且對于相對分子質量較大的蛋白質和蛋白質復合物研究困難[13]。

近年來,隨著冷凍電鏡技術的快速進步,能夠直接對液體、半液體的生物分子進行高分辨率結構測定。具體方法是,將蛋白質樣品快速冷凍,使其玻璃態化,然后通過冷凍傳輸系統放入顯微鏡觀察,通過計算機提取和重構軟件等處理得到圖像,生成準確、詳細的亞細胞和分子級復雜蛋白質結構3D模型[14]。2013年,程亦凡等[15,16]利用冷凍電鏡技術首次獲得了300 kD膜蛋白TRPV1的0.34 nm分辨率的三維結構,并建立了該分子的原子模型。自此,冷凍電鏡在結構生物學領域蓬勃發展。冷凍電鏡的研究對象十分廣泛,從細胞、細胞器到超大蛋白質復合物,均能夠進行結構解析。例如核孔復合體(nuclear pore complex,NPC)是生物體內最復雜的蛋白質復合體之一,它由30多種不同的蛋白質亞基構成,Eibauer等[17]利用冷凍電鏡技術成功解析了該復合體的精細結構,并提出了核孔控制大分子物質出入的新模型。雖然冷凍電鏡技術的發展極大加速了蛋白質的結構解析速率,但還存在價格昂貴、維護成本高、對樣品的純度和用量要求較高、表征通量低的不足。

2 非變性蛋白質質譜分析方法

近年來一系列基于質譜的結構蛋白質組學分析方法得到快速發展,表1簡要總結了各種分析方法的優點和局限。其中針對非變性整體蛋白質的質譜分析方法能夠對蛋白質和蛋白質復合物進行直接表征,其分析目標包括10～20 kDa的小相對分子質量完整組蛋白,150 kDa的大相對分子質量抗體,以及500～20 000 kDa的細胞機器(如蛋白酶體、核糖體、甚至是完整的病毒組裝體[18,19])。

表1 不同結構蛋白質組學分析方法的優缺點Table1 Advantages and limitations of the main structural proteomics methods

2.1 非變性質譜法

隨著高分辨、高質量檢測范圍質譜技術的發展,非變性質譜法(native MS)能夠對活性狀態下的完整蛋白質、非共價蛋白質-蛋白質相互作用復合物和蛋白質-受體復合物進行直接研究[20]。非變性質譜需要使用與ESI-MS兼容的揮發性緩沖液,例如乙酸銨緩沖液,濃度范圍為5 mmol/L至1 mol/L、中性pH,在此分析條件下通?？梢员３值鞍踪|的活性結構[21]。通過高分辨質譜對蛋白質復合物精確相對分子質量進行測定,可以直接確認復合物的組成形式、亞基之間的化學計量關系、解離常數等。非變性質譜法還可用于檢測蛋白質的變體、翻譯后修飾(PTMs)以及電荷分布情況。Loo等[22]利用非變性質譜表征嗜熱鏈球菌和兔的20S蛋白酶體(20S proteasome),證實了192 kDa的α7環結構和完整的690 kDa的α7β7β7α7的化學計量關系,發現哺乳動物蛋白酶體具有比細菌蛋白酶體更高的異質性。Heck等[23]使用高分辨率、高精度質譜分析激酶Plk1及其共激活因子Aurora激酶A(Aur-A)和Bora的多位點磷酸化調節蛋白質系統,發現Aur-A/Bora介導的Plk1激活伴隨著Aur-A/Bora和Plk1/Bora異二聚體的形成;同時Aur-A/Bora的相互作用獨立于Bora的磷酸化過程,而Plk1/Bora的相互作用依賴于Bora的多位點磷酸化。近年來,非變性質譜越來越多地用于研究蛋白質非共價相互作用,在研究蛋白質結構功能和組裝動力學方面表現出顯著優勢。

2.2 離子遷移質譜

離子遷移質譜(ion mobility MS)是在質譜檢測器前端添加離子遷移管,通過檢測活性蛋白質在氣相遷移過程中氣體碰撞截面的差異監測蛋白質結構的差異和構象變化[24,25],包括檢測相同蛋白質的不同構象異構體[26]和蛋白質的不同寡聚狀態[27]。具有相同質荷比的蛋白質在不同構象或聚集狀態下,由于電荷數和體積大小不同,碰撞截面不同,從而具有不同的離子遷移率[28]。因此,IMS檢測到的離子遷移率的變化能夠解釋結構變化信息,例如Marcoux等[29]利用IMS檢測配體誘導的ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白P糖蛋白的構象變化;Uetrecht等[30]通過IMS表征諾如病毒的組裝過程。

針對活性整體蛋白質的非變性質譜法目前主要分析對象還是相對分子質量較小(<150 kDa)的水溶性蛋白質,對于相對分子質量較大、疏水性較強的蛋白質如膜蛋白質及其復合物的分析仍然非常困難,需要對緩沖體系組成(表面活性劑和緩沖鹽的種類、濃度等)、儀器檢測參數等進行深入優化。

3 基于酶切肽段的結構蛋白質組學分析方法

以酶切肽段為分析對象的“自下而上”蛋白質組學分析方法在鑒定蛋白質序列和修飾方面具有巨大的優勢,不僅是蛋白質組學的標準工作流程,還可以通過結合溶液內的化學或酶促修飾手段在肽段水平上探測蛋白質分子結構和相互作用。其中,最常用的方法包括限制性蛋白質酶切、化學交聯、氫氘交換、共價化學標記和熱穩定性法等。這些方法具有分析靈敏度高、通量高、不受蛋白質相對分子質量限制、樣品用量少和純度要求低等特點,已經引領了結構蛋白質組學分析的發展方向并且成為傳統蛋白質結構分析方法的重要補充。

圖1 限制性蛋白質酶切-質譜實驗流程圖[32]Fig.1 Workflow of a LiP-MS experiment[32]Rel:Relative;int:intensity;RT:retention time.

3.1 限制性蛋白質酶切

蛋白質酶解在生物化學過程中具有重要作用,例如消化、分解代謝、蛋白質成熟/活化、信號傳導等[31]。蛋白質酶解的過程需要底物蛋白質適應蛋白酶活性位點的誘導機制形成水解反應的過渡態。當活性蛋白質區域結構不能被蛋白酶識別,例如與小分子相互作用或發生了構象變化時,則該蛋白質區域不能被蛋白酶完全水解,即產生限制性蛋白質酶切(limited proteolysis,LiP)[32],其實驗流程如圖1所示。因此,通過研究限制性酶切發生區域和效率差異可得到蛋白質相關區域的結構和相互作用信息。LiP實驗主要包括在溶液條件下使用非特異性蛋白酶,如嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)或蛋白酶K(proteinase K),處理活性狀態下的蛋白質樣品,并使用蛋白質組學定量分析方法測定酶切肽段含量變化[32],例如譜圖計數(spectra count)[33]、選擇反應監測掃描(selective reaction monitoring,SRM)[33]、細胞培養穩定同位素標記(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)[34]等定量方法。Picotti等[33,35]使用限制性酶切策略對大腸桿菌細胞內蛋白質不同生理狀態下結構變化及其與小分子相互作用情況進行高通量分析。當小分子結合活性蛋白質時阻礙了蛋白酶K水解相互作用的區域,降低了該區域蛋白酶解效率。隨后將蛋白質變性并用胰蛋白酶充分酶解,通過定量蛋白質組學分析推斷蛋白質與小分子的相互作用區域。通過此方法,Picotti等[35]發現了檸檬酸鹽和激酶Ppc間的相互作用,并通過體外酶活性測試實驗證實檸檬酸鹽對Ppc的抑制作用;同時發現了磷酸烯醇丙酮酸鹽、檸檬酸鹽和鳥苷三磷酸與激酶PfkB存在相互作用,并將其應用于鑒定新的酶-底物關系。限制性蛋白質酶切策略可以應用在規?；治龅鞍踪|結構改變、鑒定結構變化的特定區域、蛋白質聚集分析、目標蛋白質的靶向分析等方面,但是該方法對酶解條件的控制要求較為嚴格,結構分辨率不高,并且對膜蛋白質和復雜樣品中的低豐度蛋白質的結構檢測仍存在較大困難。

3.2 化學交聯法

化學交聯法(chemical cross-linking MS,CXMS)能夠用于分析蛋白質構象、蛋白質-蛋白質相互作用以及蛋白質-核酸相互作用,是近年來迅速發展的結構蛋白質組學新興方法[36]。化學交聯質譜實驗流程如圖2所示,使用特定長度的化學交聯劑共價連接單個蛋白質之內或不同蛋白質之間的功能基團,再對交聯蛋白質樣品進行酶切和蛋白質組學分析,并利用專業的交聯數據處理軟件鑒定交聯位點。最常用的交聯試劑可與氨基酸側鏈的氨基或蛋白質N端的氨基發生交聯反應,主要有二(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(bissulfosuccinimidyl suberate,BS3)、辛二酸二琥珀酰亞胺(disuccinimidyl suberate,DSS)、二(磺基琥珀酸亞酰胺)戊二酸酯(bissulfosuccinimidyl glutarate,BS2G)和雙琥珀酰亞胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate,DSG)。由于交聯試劑兩個反應基團之間的臂長限制,只有在空間距離上足夠近的兩個氨基酸才有可能被共價連接起來。通過質譜分析鑒定這些交聯位點,能夠初步確定交聯蛋白質位點間的空間距離,從而提供一種低精度的結構信息[37]。Erzberger等[38]通過化學交聯策略建立了翻譯起始復合體40S·EIF1·eIF3的結構模型,并確定了真核起始因子EIF3a的C端結構域在核糖體40S上的位置。北京生命科學研究所董夢秋團隊與中科院計算所賀思敏團隊[39]于2012年合作開發了化學交聯質譜數據處理軟件pLink,并應用于大腸桿菌蛋白質組樣品交聯結果的分析,目前該軟件可以進行蛋白質復合物和復雜樣品大規模交聯數據的解析。

圖2 化學交聯質譜實驗流程圖[40]Fig.2 Workflow of a chemical cross-linking MS (CXMS)experiment[40]

近年來,化學交聯結構蛋白質組學方法不斷發展和改進。酶解后的肽段在進入質譜分析之前,往往會采用富集或分離的手段(如體積排阻色譜[41]、離子交換色譜[42]、親和標簽富集[43,44]等)降低樣品的復雜程度以提高后續質譜分析和數據處理的準確性和通量。體內化學交聯也越來越多地應用于研究活性細胞環境中的蛋白質相互作用[45,46]。新型交聯劑的使用,如光反應性交聯劑SDAD(succinimidyl 2-((4,4′-azipentanamido)ethyl)-1,3′-dithiopropionate)[47]和可碎裂交聯劑DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea)[48],顯著提高了交聯肽段的質譜鑒定效率和可信度,使得該技術得到了更廣泛的應用。

3.3 氫氘交換法

圖3 氫氘交換質譜法實驗的基本步驟[52]Fig.3 General steps of the hydrogen-deuterium exchange(HDX)-MS experiment[52]ESIMS:electrospray ionization mass spectrometry;ETD:electron transfer dissociation.

氫氘交換法(hydrogen-deuterium exchange,HDX)作為探測蛋白質結構的手段在20世紀70年代初引入,是最廣泛使用的方法之一[49]。氫氘交換法將活性蛋白質骨架酰氨基的活潑氫原子置換為氘代溶劑(D2O、CH3OD等)中的氘原子,并通過蛋白質組學方法檢測酶解肽段質量偏移確定發生氫氘交換蛋白質區域[50]。一般暴露在外側、與溶劑密切接觸的蛋白質骨架酰氨基氫原子容易發生氫氘交換,比位于蛋白質內部或參與氫鍵形成的氫原子交換速率更快。氫氘交換的速率可以揭示溶劑中氘原子進入蛋白質特定區域能力的強弱,根據交換速率的不同和變化可以監測蛋白質的結構及動態變化[51]。此外,氫氘交換法還能夠提供蛋白質相互作用位點以及翻譯后修飾引起的構象變化信息。氫氘交換法基本步驟如圖3所示,將蛋白質樣品從H2O轉移到基于D2O的緩沖液中,實現氘代標記;然后在不同時間點酸化和冷卻溶劑以淬滅該交換反應;最后對反應混合物進行蛋白質組學分析,獲得不同肽段區域發生氫氘交換的程度異同,揭示蛋白質的溶劑可接觸區域及結構變化情況。

目前氫氘交換法越來越多地應用在膜蛋白質的結構生物學研究方面,揭示膜受體的相互作用[53,54]、膜蛋白質的構象動態變化[55]或蛋白質-膜相互作用[56]。此外,氫氘交換法是研究伴侶蛋白與底物相互作用的一種有效方法。區分特異和非特異性的伴侶蛋白-底物相互作用和底物內相互作用難度較大,并且相關相互作用在底物折疊過程中動態變化,進一步增加了相關研究的難度。D’Arcy等[57]利用氫氘交換法表征了組蛋白H2A-H2B異二聚體與其伴侶蛋白Nap1之間的相互作用,證實了Nap1可以限制H2A-H2B的構象多變性,將其部分無序的組蛋白折疊結構域轉變為更有序折疊的構象。同時他們繪制了Nap1/H2A-H2B的結合界面,揭示了Nap1和H2A-H2B內的協同解折疊現象。氫氘交換法是研究蛋白質結構和相互作用動力學的有效工具,其缺點主要是在樣品酶解、色譜分離、質譜離子化等過程中存在氫氘回交現象,需要對樣品預處理和色譜分離等條件嚴格控制,如保持溫度和低pH等,降低了色譜分離分辨率和質譜分析性能[50]。

3.4 共價化學標記

共價化學標記(covalent labeling)與HDX類似,利用蛋白質上活性基團的反應性差異來揭示結構信息。HDX主要通過探測酰胺骨架位點的反應性來監測二級結構水平的動力學蛋白質結構,而共價化學標記技術通過對氨基酸側鏈活性基團進行修飾(如氧化、乙?；?、琥珀?；?提供反應性的相關信息。溶劑暴露區域的氨基酸容易與共價標記試劑反應,而由于蛋白質相互作用或構象變化導致埋藏在蛋白質內部的氨基酸被“保護”起來,難以進行標記反應[58]。基于這種反應性的差異,利用蛋白質組學高通量分析蛋白質標記發生區域及其標記程度,即可得到相關結構信息。

羥基自由基足跡法(hydroxyl-radical footprinting,HRF)是一種廣泛使用的蛋白質結構分析共價標記方法,該方法利用羥基自由基氧化修飾蛋白質中溶劑可接觸的氨基酸位點。有17種氨基酸的側鏈可被羥基自由基氧化,其中巰基側鏈最容易發生反應,其次是芳香族和脂肪族側鏈[1]。羥基自由基可以通過多種物理或化學方法產生,包括高能同步輻射[59]、γ射線輻射[60]、脈沖電子束[61]和電化學流動池[62]等。此外,還可以通過紫外激光光解過氧化氫產生羥基自由基,這種技術通常被稱為蛋白質的快速光化學氧化(fast photochemical oxidation of proteins,FPOP)[63]。Vahidi等[64]利用FPOP考察了不同時間點的肌紅蛋白在折疊期間的氧化修飾,揭示了不同時間點不同蛋白質區域的氧化程度,結果表明肌紅蛋白的折疊由疏水側鏈的相互作用引起,如圖4所示。由于溶劑可接觸性是HRF法的主要決定因素,因此當配體結合或不同生物狀態誘導的結構變化引起溶劑可接觸性改變時,可利用HRF鑒定相互作用位點和構象變化的區域[65]。該方法也可以應用于蛋白質-DNA復合物[60],內在膜蛋白(integral membrane proteins,IMP)結合研究[66],并可用于細胞內實驗[67]。然而,HRF的氧化特異性不高,對不同氨基酸氧化效率差異可達3個數量級[59]。此外,利用物理法產生羥基自由基需要昂貴的設備,不易推廣;而基于過氧化氫的FPOP方法和其他化學催化方法需要額外加入特定試劑,可能引起蛋白質構象的變化從而影響分析結果。

圖4 通過FPOP測量肌紅蛋白折疊期間的結構變化[64]Fig.4 Structural changes during apo-myoglobin foldingas measured by FPOP(fast photochemical oxidation of proteins)[64]A-H:helix chains of apo-myoglobin;ox:oxidation;t:time.

其他共價標記的方法利用特定化學試劑對蛋白質表面的氨基酸進行修飾,通過氨基酸反應性檢測蛋白質結構。不同于HRF中羥基自由基需要專門設備產生,化學試劑直接添加到蛋白質溶液中進行標記反應。標記試劑可以分為兩類,包括氨基酸特異性標記與非特異性標記。例如,二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)是一種非特異性的標記試劑,可通過親核取代反應修飾多種親核殘基(半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸)的側鏈和蛋白質的N端[68,69]。然而,一些修飾的殘基,特別是絲氨酸和蘇氨酸,在溶液中保留太久會發生水解,導致標記丟失,因此必須在標記反應完成后立即酶解和質譜分析[70]。TMT(tandem mass tag)基于琥珀酰亞胺基團可以特異性修飾賴氨酸側鏈和蛋白質N端,根據標記反應的動力學信息可以獲得蛋白質結構的相關信息[71]。此外,Cravatt課題組[72]設計了基于活性分子探針的蛋白質標記方法(activity-based protein profiling,ABPP)?；钚苑肿犹结樣蓤蟾婊鶊F、反應基團和將二者相連的聚乙二醇鏈或者碳鏈組成,報告基團可以是生物素基團、熒光基團或者是便于引入新的化合物的正交反應基團等,反應基團一般是親電小分子,用于選擇性結合蛋白酶的活性中心并與具有重要催化功能的親和氨基酸反應,從而將分子探針共價標記到蛋白質上[73]。Cravatt課題組[74,75]將該方法應用于人體細胞裂解液中蛋白質活性位點中半胱氨酸和賴氨酸的規?；b定,將活性分子探針作為競爭性抑制劑直接加入蛋白質組,從而定位靶標蛋白質和靶點,為小分子與蛋白質的相互作用、抑制劑的設計等提供指導。

目前常用的共價標記方法主要針對賴氨酸上的伯氨基團和半胱氨酸上的巰基,相關標記反應如琥珀酰化等可能引起蛋白質電荷、疏水性、結構的改變從而導致蛋白質失活[76,77]。此外,目前常用的標記反應試劑的物理化學性質較為復雜、尺寸較大、空間位置效應明顯,只能探測蛋白質暴露于溶劑且沒有較大位阻的區域,對于一些有較大位阻的蛋白質活性中心區域的結構變化難以探測。因此,基于共價化學標記的蛋白質組學結構分析方法目前仍面臨挑戰,亟須發展一種不改變蛋白質結構和生物活性的共價化學標記策略,同時降低標記試劑尺寸和空間位阻效應,使其可以探測蛋白質中位阻較大的活性中心區域,從而提高結構蛋白質組學分析的準確性。本課題組[78]發展了一種活性蛋白質二甲基化標記新方法用于研究膜蛋白質復合物中賴氨酸的反應性及其近程微環境(lysine proximal microenvironment,LPM)。由于標記試劑相對分子質量小(CH2O和NaBH3CN),能對蛋白質復合物中的幾乎全部賴氨酸進行結構特異性差異標記;并且該反應不影響蛋白質電荷情況,在標記后蛋白質仍然能夠保持生物學活性,實現了超大相對分子質量膜蛋白質復合物(700 kDa)中賴氨酸反應活性和近程微環境的高通量、全面分析。此外,本課題組[79]將該方法進一步應用于小分子配體對蛋白質受體的分子識別和結構調控機制解析,如圖5所示,通過可視化賴氨酸反應性的變化值監測膜受體蛋白質的動態結構調節模式。相關結果證明,該方法不僅可以發現小分子與蛋白質的直接作用界面區域,還可以監測蛋白質發生了誘導構象變化的其他區域,為研究小分子配體的作用機制提供了一種全新的質譜分析方法,有望應用于靶向藥物的篩選、評估和優化。

圖5 完整蛋白質活性二甲基標記示意圖[79]Fig.5 Schematic diagram of the active dimethyl labeling of intact proteins[79]

3.5 熱穩定性分析法

圖6 蛋白質組熱穩定性高通量定量分析[81]Fig.6 Quantitative protein-wide profiling of protein thermal stability[81]TMT:tandem mass tag.

蛋白質組的熱穩定性分析法(thermal proteome profiling,TPP)可以通過分析蛋白質不同構象/結構在高溫下穩定性的差異高通量探測蛋白質的結構變化。蛋白質在高溫下會發生部分變性聚集,從而導致在溶液中的含量減少,在細胞裂解液中添加小分子藥物,通過定量蛋白質組學方法分析添加小分子前后蛋白質在不同溫度下熱穩定性的差異即可得到小分子藥物的潛在作用底物蛋白質[80],見圖6。Savitski等[81]利用該方法系統分析了小分子配體的靶向蛋白質底物,例如確定了激酶抑制劑staurosporine的50多個蛋白質靶點,如激酶PKN1 (protein kinase N1)和AURKA(aurora kinase A);觀察到過釩酸鹽誘導的T細胞受體信號傳導中的熱變化,影響ATP(adenosine triphosphate)結合膜蛋白ATP1A1和轉運蛋白MDR1(multidrug-resistance transporter)[82];揭示了組蛋白去乙?；敢种苿﹑anobinostat對苯丙氨酸羥化酶的抑制作用[83];同時將該方法應用于蛋白質降解與合成的動態分析,例如揭示雷洛昔芬誘導雌激素受體TMEM97降解失調,影響膽固醇體內平衡調節劑等[84]。這種檢測熱穩定性變化的方法能有效鑒定藥物的蛋白質底物,有助于系統研究藥物功效和毒性。然而,該方法不能給出藥物與底物蛋白質的具體結合位點和區域信息,不能用于小分子配體和底物蛋白質的分子識別和作用機制研究。

4 展望

基于質譜的結構蛋白質組學分析方法是常規結構生物學分析(XRD、NMR和cryo-EM)的重要補充。其特點在于不受所分析蛋白質樣品的純度、尺寸的限制,可以對復雜活性蛋白質樣品進行高通量動態分析,特別適合分析活性蛋白質復合物在外界刺激如藥物小分子結合時的結構/構象動態變化分子機制。結構蛋白質組學分析在探索蛋白質結構和相互作用方面有著廣泛的應用前景,通過新方法新技術的開發有望將結構生物學進一步推向組學分析的新層次,能夠更為深入地探索復雜生物分子之間的相互作用網絡和結構/構象協同分子機制,從而更好地闡釋各種生物學過程。要實現此目標,結構蛋白質組學分析還需要從以下幾個方面進行創新和發展,包括:(1)由于質譜分析需要引入質量標簽,因此需要發展在細胞或動物中進行活體標記的方法,包括新的標記試劑和新的標記反應,在不影響蛋白質活性、結構和生理狀態下實現復雜體系中蛋白質特定氨基酸或某一類氨基酸的高效標記,通過標記的蛋白質區域和程度實現結構的動態監測;(2)在數據處理方面,需要在整合已有的X射線晶體衍射和電鏡結構數據的基礎上引入結構蛋白質組學分析數據,從而模擬蛋白質和蛋白質復合物結構的動態變化分子機制以及與其他生物分子的相互作用情況;(3)高通量的液相色譜-質譜技術的發展,進一步提高復雜樣品中蛋白質分析的序列覆蓋率,實現組學層次上蛋白質結構的全面動態分析;(4)質譜技術的進一步發展,實現復雜活性蛋白質組樣品的直接質譜分析,也就是目前逐漸引起關注的非變性整體蛋白質組學分析(native top-down proteomics),這依賴于質譜分辨率的提高、檢測相對分子質量范圍的擴大、氣相解離技術的進步以及對氣相反應和解離機理與規律的進一步深入認識。

綜上所述,結構蛋白質組學分析的序幕已經拉開,將成為化學、生物學、醫藥健康等多個領域交叉研究的熱點。相信在不久的將來,基于質譜的結構蛋白質組學方法將在疾病相關蛋白質的功能分析和藥物篩選等方面發揮越來越重要的作用。