基于液相色譜-質譜聯用技術的妊娠期糖尿病患者臍帶血代謝組學網絡分析

吳 衍,張 西,張 潔,張雪芹,申河清

(1.中國科學院城市環境研究所,中國科學院城市環境與健康重點實驗室,廈門 361021;2.中國科學院大學,北京 100049;3.廈門市婦幼保健院,廈門 361003)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是常見妊娠期并發癥,其定義為妊娠期間首次檢測出不同程度的糖代謝異常。流行病學研究[1]指出,我國城鎮地區妊娠期糖尿病的發病率在1999～2012年間增加3倍。雖然GDM患者在分娩后糖代謝異常能夠恢復至正常水平,但其患糖尿病風險相較正常孕婦有增加的趨勢,同時圍產期GDM導致的糖脂代謝異常也會對子代遠期健康產生不利影響[2]。目前研究認為胰島素抵抗是導致GDM的重要原因。孕婦通過早期脂肪組織積累以及圍產期脂肪分解加強來滿足胎兒生長的需要,而脂質代謝過程的變化直接影響胰島素分泌以及胰島素抵抗水平的改變[3]。其中,圍產期胰島素對于脂質分解的抑制作用減弱在GDM孕婦中更為明顯,并且其效應會進一步導致GDM孕婦餐后脂肪酸累積、肝葡萄糖增加以及更為嚴重的胰島素抵抗[4]。此外,孕婦脂肪酸小分子可以通過胎盤直接供給胎兒,但對于復雜的脂質則需要通過特定滋養層脂肪酶水解才能通過胎盤轉運,因此母親代謝狀態的改變往往會影響胎兒各類代謝物水平和代謝穩態的改變,進而導致如巨大兒、血液中必要元素缺乏、呼吸窘迫綜合征和室間隔增厚等疾病風險的增加[5,6]。雖然通過GDM胎盤基因層面的研究表明,與能量代謝相關的49個基因表達發生了變化,但對于GDM條件下母嬰界面代謝的分子機制尚不明確[7]。

近年來,隨著色譜分離、質譜檢測以及數據處理能力的不斷增強,基于液相色譜-質譜聯用技術構建的代謝組學平臺在疾病診斷、藥物作用機制以及病理機制研究中發揮著越來越重要的作用[8,9]。代謝物作為基因的下游產物,能夠最直接反應疾病與健康之間的表型差異,并且基因、轉錄、蛋白質層面的差異能夠在代謝層面上被放大表達[6]。同時,對于包括飲食、生活習慣、生存環境、藥物使用等環境因子作用下生物體表型的差異,代謝組學也能夠很好地說明。本課題組[10]前期對于胎便代謝組學的研究也發現,GDM條件下胎兒的氨基酸與脂質代謝存在差異表達。在此基礎上,本研究通過非入侵性樣品臍帶血探究GDM條件下母嬰界面之間代謝輪廓的變化,并結合網絡分析探究差異代謝物在母嬰代謝網絡中的作用,這將有助于理解GDM對子代代謝網絡構建的影響,為孕期并發癥的預防和治療提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

UPLC-Q-Exactive超高效液相色譜-質譜聯用儀(美國Thermo公司);Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司);Milli-Q超純水系統(德國Merck公司)色譜純;甲酸和甲醇(色譜純,德國Merck公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);真空濃縮儀(美國Thermo公司)。

1.2 臍帶血樣品收集與制備

本研究通過中國科學院城市環境研究所以及廈門婦幼保健院倫理委員會批準。研究人群是橫斷面研究(n=2 602)中的巢式病例對照研究。所有參與者都簽署知情同意,并且樣品排除了包括B組溶血性鏈球菌感染、異常子宮、α地中海貧血、胎膜早破、甲狀腺功能障礙、胎盤障礙、子癇前期、巨大胎兒、胎兒窘迫、高血壓、早產、肩難產等消除混雜因素的影響。所有孕婦均為足月自然分娩孕婦。最終確定了106例孕婦最為研究對象,通過病例回溯,其中31例GDM孕婦作為GDM病例組,而75例無明顯圍產期并發癥孕婦作為健康對照。臍帶血樣品在孕婦分娩后采集,血液樣品靜置2 h后,以3 000 r/min的速度離心10 min后取上清液,于-80 ℃保存。

根據文獻方法[11],采用甲醇-血清體系提取代謝物并沉淀蛋白質,血清樣品解凍后取100 μL于離心管中,加入300 μL甲醇,渦旋1 min。于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min,取上清液于離心管中。上清液于真空離心濃縮儀中濃縮至干燥。將干燥后的提取物復溶于100 μL甲醇-水(1∶1,v/v)中,渦旋1～2 min至完全溶解,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min,取上清液于液相色譜瓶中待上機檢測。從每個血清樣品中取等量并混合,制備為質量控制(QC)樣品待上機檢測。

1.3 色譜與質譜條件

代謝組學色譜分離采用反向液相分離體系,根據文獻方法[11,12],采用甲醇-水體系分離血清代謝物,進樣量為5 μL,柱溫為40 ℃,樣品室溫度為4 ℃。流動相A為含有0.1%(體積分數,下同)甲酸的超純水,流動相B為含0.1%甲酸的甲醇,流速0.3 mL/min。洗脫梯度:0～1.0 min,100%A;1.0～21.0 min,100%A ～95% B;21.0～22.0 min,95%B～100%B;22.0～24.0 min,100%B;24.0～24.1 min,100%B～100%A;24.1～25 min,100%A。電噴霧離子源分別采用正模式(ESI+)和負模式(ESI-)采集數據,全掃描模式下設定其分辨率為70 000,質譜掃描范圍為m/z70～1 000。噴針電壓在正負模式下均為3 500 V。通過QC樣品對儀器穩定性進行評估,樣品使用隨機進樣順序,QC樣品平行穿插于整個分析隊列中,每測定20個樣品測定1次QC樣品及空白溶劑。二級質譜碰撞能量分別為25、35和45 eV。

表1 GDM病例和健康對照孕婦的人口學及臨床指標Table1 Demographic and clinical data of GDM(gestational diabetes mellitus)case and healthy pregnant women control

p:the statistical significance was assessed using the Mann-Whitney U test.BMI:body mass index.

1.4 數據處理

LC-MS離子信息通過Compound Discovery軟件(CD,美國Thermo公司)實現包括峰提取、峰對齊、未知物的檢測、未知物組成預測以及數據庫匹配,并且軟件提供了最后的離子特征峰信息。通過QC-RLSC(quality control-robust LOESS signal correction)模型進行QC校正后,獲得的離子信息進行求和歸一化,并導入SIMCA-P 14進行主成分分析(PCA)以及正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)[11,13]。人內源性代謝物鑒定基于HMDB數據庫分析。Spearman相關性分析、均值檢驗以及變化倍數計算基于MetaboAnalyst在線平臺和SPSS軟件(Version 18);網絡分析模型采用Gephi軟件;多元線性回歸采用R語言。本研究設定p<0.05具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 人口學及臨床指標

參與的106名母親均為足月自然分娩,具體人口學與臨床指標如表1所示。其中,產婦年齡主要集中在25～31歲(占總人群數的25%～75%),孕前身體質量指數(BMI)指數為(20.35±3.13)kg/m2(中位數±標準差)。與此前流行病學研究[14]一致,研究人群中年齡和孕前BMI在疾病對照組間存在顯著性差異。即使排除了其他圍產期并發癥等混雜因素的影響,BMI和GDM之間相關性依然存在,說明產前母親肥胖與GDM之間的相關性相對獨立。因此,孕婦產前超重或肥胖導致的代謝環境的改變可能是GDM發病的一個重要因素[15]。

2.2 血清代謝物譜差異分析

利用UPLC-Q-Exactive-MS平臺,采用正負兩種離子源模式采集臍帶血代謝物質量信息,代謝輪廓譜圖如圖1所示。本研究利用QC-RLSC模型校正因儀器長時間運行產生的信號誤差。QC樣品在非監督學習模型PCA得分圖中明顯聚類且聚類范圍較小,說明儀器測定離子信息保留時間和離子強度重現性好,數據滿足代謝組學分析要求(見圖2)。

基于CD軟件提取離子特征峰信息,通過HMDB數據庫比對,本研究確認了136個內源性代謝物,其中與脂質代謝和氨基酸代謝相關的內源性代謝物分別占37.5%和30.8%。內源性代謝物種類鑒定說明母嬰代謝物質交換過程中氨基酸和脂質類代謝物是重要的組成部分,并且已有研究表明GDM產婦臍帶血中支鏈氨基酸、芳香族氨基酸以及脂肪酸含量與健康產婦臍帶血中的含量有明顯差異[4]。

為了說明GDM孕婦臍帶血的代謝變化,并且減少代謝物相互關系對于差異代謝物判別能力的影響,本試驗采用OPLS-DA鑒定不同表型下顯著的差異代謝物。如圖2所示,OPLS-DA結果表明,GDM孕婦與健康孕婦之間臍帶血代謝輪廓存在明顯差異。根據均值檢驗、變化系數以及判別式模型重要性分析結果鑒定出與脂質代謝相關的5個代謝標志物,包括四氫可的松(tetrahydrocortisone)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、酮基膽固醇(7-ketocholesterol)、膽甾-4,6-二烯-3-酮(cholesta-4,6-dien-3-one)以及酰肉堿(9,12-hexadecadienoylcarnitine,acyl carnitine C16∶2)(見表2)。同時,GDM代謝標志物分析表明,5個差異代謝物在GDM孕婦臍帶血中顯著降低,這也說明GDM表型下母嬰界面脂質代謝穩態的異常變化(見圖3)。

圖1 臍帶血清代謝輪廓譜圖Fig.1 Metabolic profiling of umbilical cord serum Control:healthy pregnant woman metabolome;case:GDM pregnant woman metabolome.

圖2 臍帶血清代謝組分析Fig.2 Umbilical cord serum metabolomics analysis a.metabolic profiling of umbilical cord serum;b.quanlity control (QC)clustering results in principal component analysis (PCA)score plots;c.metabolome OPLS-DA (orthogonal partial least squares discriminant analysis)score plots of umbilical cord serum.In PCA,the circles and the stars are umbilical cord blood samples and QC,respectively.In OPLS-DA,the black dots and the triangles are GDM cases and health control,respectively.Sample:GDM case sand health pregnant woman control metabolomes.

表2 GDM的代謝標志物Table2 GDM metabolic markers

VIP:variable influence on projection;FC:fold change between healthy control and GDM case groups;p:the statistical significance was assessed using the Mann-Whitney U test.

圖3 GDM標志代謝物小提琴圖Fig.3 Violin plot of GDM metabolic markers * indicates p<0.05;** indicates p<0.01.The red columns represent MS/MS fragments (from Table 2)which match the HMDB database.

2.3 標記代謝物與脂質代謝網絡關系

與核磁共振波譜法和氣相色譜-質譜技術相比,液相色譜-質譜聯用平臺對于血液和尿液中代謝物檢測覆蓋度更廣,這也為網絡分析提供了可能性。本研究的GDM代謝標志物與脂質相關,因此構建GDM代謝標志物的脂質代謝網絡能夠進一步說明GDM母親臍帶血的代謝變化。基于Spearman相關性結果,設定相關系數閾值(β0=0.5)考察中等相關強度的核心代謝網絡。利用OpenOrd算法剔除非相關獨立節點,通過力導向布局算法ForecAtlas2構建脂質代謝拓撲網絡。如圖4a所示,其中溶血卵磷脂和脂肪酸類代謝物構建起核心脂質代謝網絡,而在妊娠期糖尿病孕婦胎盤基因表達的研究中也發現與能量代謝相關的49個明顯變化的基因中有67%與脂質通路相關,而與葡萄糖代謝通路有關的基因僅占9%[7]。同時,代謝標志物中花生四烯酸(AA)與核心代謝網絡相關性較強,而其他代謝標志物與脂肪酸能量代謝過程中的三羧酸循環通路相關。通過網絡模塊化分析表明(模塊解析度1.5),GDM孕婦臍帶血代謝標志物中花生四烯酸的變化會直接影響其通路相關代謝物白三烯A4(LTA4)、前列腺素E2(PGE2)的變化(見圖4b)。

進行網絡節點重要性分析(網絡加權度),結果如圖4所示,網絡節點大小與其在脂質代謝網絡中重要性成正比,表明GDM標記代謝物中花生四烯酸(AA)與脂質代謝網絡的重要節點顯著相關。同時,在BMI和年齡作為校正因素下,多元線性回歸模型的結果也表明臍帶血中AA含量與母親是否患有GDM存在顯著相關性(見表3)。

圖4 脂質代謝網絡分析Fig.4 Network analysis of lipid metabolism a.correlation between the metabolic biomarkers and the key network of lipid metabolism.The red and green dots were GDM metabolic biomarkers and key metabolic network nodes,respectively.b.module analysis of the lipid metabolism network.The different colors correspond to different modules using modularization analysis of metabolic networks.AA:arachidonic acid;EPA:eicosapentaenoic acid;PGE2:Prostaglandin E2;LTA4:leukotriene A4.

表3 GDM代謝標志物脂質代謝網絡重要性分析Table3 Weight analysis of GDM metabolic markers in the network of lipid metabolism

pwas tested using multiple linear regression,and the adjustment factors were BMI and age.

2.4 臍帶血代謝標記物相關的代謝過程

本研究發現GDM條件下,母嬰交互界面中不飽和脂肪酸代謝發生了顯著性變化,其中生物標志物花生四烯酸在GDM臍帶血中含量明顯偏低(見圖3),并且其代謝過程對于整體脂質代謝網絡影響較為顯著。相關分子生物學研究[16]表明,細胞膜磷脂脂肪酸的成分對于胰島素分泌及其自身生物學效應都有重要的作用,特別是AA以及二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid (22∶6n-3),DHA)對胰島素抗性的影響。同時,部分研究[5,17]通過比較健康和GDM母親血清和臍帶血中非飽和脂肪酸含量也表明,GDM母親血液以及臍帶血中AA與DHA的含量顯著偏低,但是GDM母親臍帶血中飽和脂肪酸的比例明顯升高。雖然沒有證據表明是胎盤轉運或者是母親自身代謝異常導致脂質組分的變化,但是包括AA與DHA在內的n-6和n-3不飽和脂肪酸在臍帶血中含量的減少會導致胎兒對相應脂肪酸利用率的增強,而其代謝穩態的改變可能會影響子代長期健康狀態[5]。另一方面,本研究發現在AA影響的核心網絡中,溶血磷脂酰膽堿(LPC)也是其中一個重要組成部分,而目前LPC代謝在孕期對母嬰健康的影響還尚未確定。

3 結論

本研究通過液相色譜-質譜對人臍帶血血清代謝組學研究,鑒定了與脂質代謝相關的5個潛在生物標志物。通過標志物與GDM臍帶血脂質代謝物的表達網絡分析說明,GDM條件會對母嬰之間脂質代謝特別是不飽和脂肪酸產生影響。本研究提供了評估代謝標志物生物學權重的新思路,發揮液相色譜-質譜優勢,提高了代謝組學數據的利用率,同時也為組學在GDM病理研究和治療以及多組學結合的精準醫學提供了可行的方法。