血清外泌體的蛋白質組分析及其在骨質疏松中的應用

霍春暉,李英華,喬 智,尚 志,曹成喜,洪 洋,肖 華*

(1.微生物代謝國家重點實驗室,上海交通大學生命科學技術學院,上海 200240;2.復旦大學附屬第五人民醫院,上海 200240;3.上海交通大學電子信息與電氣工程學院,上海 200240)

外泌體是細胞分泌的具膜小體,尺寸在30～150 nm之間,具有穩定的雙層膜結構,可以選擇性地包裹大量生物活性物質,如蛋白質、脂質和核酸等[1,2]。外泌體屬于細胞外囊泡,在進入細胞外微環境后,通過膜融合的方式,將內含的物質傳遞到受體細胞中,進行物質的交流和傳遞,可以反映人體的生理和病理狀態[3,4]。據文獻[5]報道,惡性細胞分泌的外泌體與疾病的發生發展密切相關,并影響正常細胞的功能,同時可以促進腫瘤的轉移和血管的生成,或引起體內的免疫應答等功能。外泌體攜帶大量的蛋白質,目前的研究表明,外泌體蛋白質可用于多種疾病的臨床診斷和機制研究。例如,乳腺癌患者血漿外泌體中RALGAPA2等蛋白質相對正常人顯著上調,有望用于乳腺癌的早期分子篩查[6]。定量蛋白質組學分析表明,骨質疏松患者的血清外泌體參與抑制體內成骨細胞的生長過程[7]。因此,對外泌體蛋白質組進行深入研究,一方面可以更好地理解疾病的發生發展機制,另一方面可以為疾病的分子診斷和治療提供支持,加速推進精準醫療。

隨著人口老齡化程度的加重,骨質疏松癥已日益成為我國嚴重的健康問題,給社會和家庭帶來了巨大的負擔[8]。骨質疏松癥的發生是由于人體內負責骨吸收的破骨細胞與決定骨形成的成骨細胞之間的骨動態平衡被打破,當骨形成的能力弱于骨吸收的能力,會引起骨密度降低,導致骨骼微結構惡化,從而增加臨床骨脆性骨折的發病風險[9,10]。由于骨量減少的過程往往非常緩慢且缺乏明顯癥狀,患者在早期骨量減少階段很難意識到疾病的存在[11],一般在骨折之后才會意識到嚴重性,但已錯過了最佳的預防和治療時機。

臨床上常用雙能X射線法測定人體骨密度,評估骨量狀態和罹患骨折的風險并診斷骨質疏松。世界衛生組織對骨密度診斷骨質疏松癥的評價是測定T值進行評估,T值的定義為(測定值-同性別同種族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度標準差,通常當骨密度T值≤-2.5為時骨質疏松,當-2.5-1.0時為健康狀態[12]。但是通常情況下,骨密度只能反映骨量的多少,很難體現骨質量的高低,如骨礦化等,所以骨密度診斷法有時不能很準確地判斷骨量狀態,且很難分辨患者在接受治療后的骨平衡狀態[13]。骨轉換生化標志物的檢測也經常用于骨質疏松癥的診斷,如N-telopeptide、C-telopeptide等,對這些生化標志物含量的測定,在預后評價上有著更大的優勢。通過觀察這些物質的含量變化,可以更好地了解骨吸收和骨形成動態過程,用來評估骨平衡狀態。但是這些體液中的標志物容易受到飲食、性別和體液內酶影響,靈敏度不是很高[14]。因此,急需發展特異性生物標志物,用于骨質疏松癥的篩查,促進骨質疏松的預防和治療。

外泌體蘊含豐富的蛋白質,有望作為骨質疏松癥早期診斷標志物。對骨質疏松癥患者血清外泌體的蛋白質組學進行研究,可以更好地從蛋白質水平去理解骨量流失過程,找出在骨質疏松癥狀態下發生變化的蛋白質,作為臨床診斷特異性的標志物。本文對血清外泌體進行了分離分析和表征,對正常人、骨量減少患者和骨質疏松患者血清中的外泌體采用基于液相色譜-質譜的技術進行定量蛋白質組學分析,發現骨量減少過程中外泌體蛋白質組所發生了系統性變化,為骨質疏松疾病的篩查和診斷奠定了基礎。

表1 入組樣本的臨床信息Table1 Clinical information of the enrolled samples

1 實驗部分

1.1 血清樣本的收集

本研究所用血清樣本均由復旦大學附屬上海市第五人民醫院提供,樣本提供者在樣本采集前均簽署了書面知情同意書,12例臨床樣本信息匯總見表1。所有實驗方案和操作步驟均根據上海交通大學Bio-X倫理委員會批準的方案(IRB#M15017)進行。血液樣本均按照批準的方案進行收集,具體步驟為,首先將收集的血液置于含促凝劑的離心管中,室溫放置20 min直至部分凝固,然后以2 000 g的速度離心20 min,去除血細胞和血小板,最后將得到的血清分裝到1.5 mL管中并置于-80 ℃冷凍儲存,用于后續實驗。

1.2 儀器、試劑與材料

血清外泌體蛋白質組分析采用液相色譜-質譜系統,包括納升液相色譜(EASY nL Thermo,Fisher Scientific,USA)和四極桿超高分辨軌道阱質譜儀(Q Exactive Plus,Thermo Fisher Scientific,USA),用于蛋白質的定性和定量分析。超高速離心機(Beckman,USA)用于外泌體的分離富集。納米粒徑分析儀Nano Sight S300(Malvern,UK)用于外泌體粒徑分布和濃度檢測。透射電子顯微鏡(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)用于觀察血清外泌體的形態。

質譜級乙腈和甲酸溶液購于Thermo Fisher Scientific公司(USA)。RIPA裂解液(Millipore,USA)用于外泌體的破膜處理和蛋白提取。Pierce?BCA蛋白試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)用于總蛋白濃度的測定。測序級胰蛋白酶(Promega,USA)用于蛋白質的酶解。Fast Silver銀染試劑盒(Beyotime,中國)用于SDS-PAGE蛋白膠條的染色。CD63(ImmunoWay,USA)、TSG101(Abcam,UK)和CD9(Abcam,UK)抗體用于血清外泌體的表征。

圖1 血清外泌體的分離和蛋白質組學分析流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the isolation and proteomicsanalysis of serum exosomes

1.3 血清外泌體的分離富集

血清外泌體的分離按照文獻[15]方法進行,步驟如圖1所示。首先將血清樣本和PBS(phosphate buffered saline)溶液以1∶20(v/v)的比例充分混勻稀釋,并以300 g的速度離心10 min去除血細胞和血小板,將上清以2 600 g的速度離心20 min去除沉淀。得到的上清在10 000 g的速度下離心60 min,去除微囊泡。對所得上清以100 000 g的速度離心120 min,得到血清外泌體,以PBS溶液對血清外泌體進行重懸洗滌,以100 000 g的速度離心120 min,重復洗滌步驟兩次,棄去上清,得到最終的血清外泌體。將所得外泌體重懸在100 μL PBS溶液中,加入10 μL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制劑,置于冰上60 min進行破膜和蛋白質提取,采用BCA(bicinchoninic acid)法測定外泌體蛋白質濃度,并于-80 ℃下保存,以備使用。所有操作步驟均在4 ℃下進行。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

分別將2 μg血清蛋白質和血清外泌體蛋白質點樣進10%SDS-PAGE凝膠(GenScript,USA)中,以120 V電壓運行70 min。預染色的蛋白標記物(Life technologies,中國)用來追蹤蛋白質遷移,觀察電泳情況。采用Fast Silver銀染試劑盒進行染色,使用EPSON Perfection V700 PHOTO(EPSON,中國)掃描凝膠圖像。

1.5 外泌體的納米粒徑分析

將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中,充分振蕩混勻后,取10 μL,用超純水稀釋至1 mL,注入Nano-Sight S300納米粒度分析儀中,按照標準流程進行粒徑分布和濃度的測定。測試溫度為4 ℃。每個樣本的取樣分析次數設定為3次。采用Nano-Sight NTA(V 3.2)軟件對實驗結果進行分析,取3次擬合結果。

1.6 外泌體的透射電鏡分析

將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中,取10 μL滴在電鏡測試的銅網上,室溫下靜置5 min,然后用濾紙吸去浮液,再用超純水洗3次,待其風干之后加10 μL磷鎢酸溶液于銅網上,靜置染色2 min后用無塵濾紙吸去殘液,室溫下靜置風干,制成電鏡測試樣本,上機分析。采用透射電鏡(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)在80～120 kV下觀察血清外泌體的形貌。

1.7 蛋白免疫印跡分析

采用蛋白免疫印跡對血清外泌體的標志性蛋白質進行檢測,包括CD63(CD63 antigen)、TSG101(tumor susceptibility gene 101 protein)和CD9(CD9 antigen)。簡要實驗步驟為:(1)SDS-PAGE分離:分別取10 μg外泌體蛋白質和血清上清液蛋白質,上樣到10% Bis-Tris蛋白質凝膠中,在120 V下電泳70 min。(2)轉膜:將預先用乙醇活化好的PVDF膜準備好,采用濕轉法在恒定電流200 mA的轉膜緩沖液中遷移60 min,將SDS-PAGE膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上。(3)封閉:將PVDF膜用PBST(phosphate buffered saline Tween-20)溶液簡單清洗后,加5%(質量分數)脫脂牛奶并在室溫下輕微振蕩,封閉60 min。(4)一抗孵育:按照抗體說明書推薦的比例用BSA溶液稀釋一抗,與PVDF膜在4 ℃下孵育過夜。(5)二抗孵育:將一抗孵育過夜后的膜以PBST溶液洗滌3次,然后加入相應的二抗,在室溫孵育1 h。(6)顯色:加入ECL(electrochemiluminescence)顯色液,反應幾分鐘之后,用EPSON顯影儀器進行化學發光檢測。

1.8 蛋白質酶解

采取FASP(filter-aided sample preparation)酶解方式進行蛋白質酶解[15]。具體實驗步驟為,首先將外泌體蛋白質和5倍體積的50%(體積分數,下同)乙醇、50%丙酮和0.1%乙酸組成的有機溶液充分混勻,在-20 ℃下過夜。將得到的蛋白質沉淀溶解于60 μL 6 mol/L鹽酸胍溶液中。加入2 μL DL-二硫蘇糖醇(DTT),在60 ℃下還原60 min,然后加入10 μL吲哚-3-乙酸(IAA),在避光條件下烷基化40 min。將得到的蛋白質溶液轉移到10 kDa過濾管中,并在4 ℃下以12 000 g的速度離心20 min以濃縮蛋白質,按酶:蛋白質=1∶20(質量比)的比例加入胰蛋白酶(Promega,USA),在37 ℃下反應16 h,將外泌體蛋白質充分酶解成肽段。

1.9 液相色譜-質譜條件和免標記定量分析

1.9.1液相色譜-質譜條件

采用納升液相色譜-四極桿超高分辨軌道阱質譜儀對外泌體蛋白質進行定性和定量分析。將外泌體蛋白質的肽段重溶在0.1%甲酸水溶液中,取等量(1 μg)肽段樣品進樣到色譜系統中,以200 nL/min的流速通過15 cm長的分析型反相色譜柱(15 cm×75 μm,3 μm,C18,Thermo Fisher Scientific),運行120 min色譜梯度進行分離。流動相A為99.9%水和0.1%甲酸混合液,流動相B為80%乙腈水溶液和0.1%甲酸混合液。洗脫的梯度為0～25 min,2%～8%B;25～90 min,9%～20%B;90～106 min,20%～30%B;106～109 min,30%～95%B;109～117 min,95%B;117～119 min,95%～2%B;119～120 min,2%B。采用ESI正極模式,電噴霧電壓為2.0 kV,離子源溫度為275 ℃,選擇質荷比在350～1 500之間且電荷數為2～7的母離子進行二級碎裂,采用數據依賴性掃描模式。母離子掃描分辨率設為70 000,自動增益控制(automa-tic gain control,AGC)為106,碰撞能量設置為28,在Orbitrap中以17 500的分辨率檢測離子碎片。動態排除時間設置為30 s,在一個MS掃描之后交替進行20次MS/MS。

1.9.2質譜數據分析處理

對采集的質譜數據,通過MaxQuant軟件進行分析處理,在Human SwissProt數據庫(548208序列)中進行蛋白質鑒定。搜索條件設置為:最多允許2個胰蛋白酶漏切位點,氧化修飾和乙?；揎椩O為可變修飾,前體和碎片離子的質量誤差分別為6 ppm(10-6)和0.5 Da。蛋白質鑒定的標準為:至少檢測到2個特征肽段,p<0.05,且假陽率(FDR)小于1%。通過在MaxQuant中使用基于強度的絕對定量(intensity-based absolute quantification,iBAQ)對鑒定的肽段進行定量分析,將每種蛋白質的iBAQ對其所在樣品總iBAQ值的貢獻進行歸一化處理,且至少根據該蛋白質的兩個特征肽段iBAQ值來確定其相對豐度。計算差異蛋白質的變化倍數和p值,p<0.01表示組間存在顯著差異變化,變化倍數大于2視為顯著上調,小于0.5則表示顯著下調。

2 結果與討論

本文對血清外泌體進行了分離富集和表征,并對血清外泌體蛋白質組進行了定性分析。通過對正常對照組、骨量減少組和骨質疏松癥的血清外泌體進行定量蛋白質組分析,發現骨質疏松相關蛋白質。

圖2 血清外泌體的表征Fig.2 Characterization of serum exosomes a.Exosomes particle size distribution.b.Western blotting analysis of CD63 (CD63 antigen),TSG101 (tumor susceptibility gene 101 protein),and CD9 (CD9 antigen)in exosomes (Exo)and serum supernatant (Sup).c.Transmission electron microscope images of exosomes.

2.1 血清外泌體的分離富集和表征

血清樣本黏度很高,且含有大量高豐度蛋白質,不利于外泌體分離,因此,在分離富集之前用PBS溶液按照1∶20的體積比對血清進行稀釋,然后再進行差速分離。對分離富集得到的外泌體,分別進行納米粒徑分析、透射電鏡分析和免疫印跡分析,表征結果如圖2所示。從圖2a外泌體的粒徑分布結果可以看出,富集到的外泌體尺寸大小在30～150 nm之間,并且其粒徑峰值在97 nm處。外泌體的濃度為2.05×109particles/mL。接著,采用免疫印跡方法對外泌體表面特異性標志物CD63、TSG101和CD9進行了驗證,同時以血清上清蛋白質作為對照,結果如圖2b所示,這3種標志物在外泌體蛋白質中的表達強度很高,但在血清上清中沒有表達或表達量很低。最后對外泌體進行了透射電鏡分析,直接觀察其形貌,結果如圖2c所示。血清外泌體的尺寸大小在100 nm左右,為橢圓形,符合外泌體的形貌特征。以上結果說明成功富集到了血清外泌體,所用外泌體分離流程可以用于后續骨質疏松實驗。

2.2 血清外泌體的蛋白質組研究

對提取的外泌體蛋白質進行SDS-PAGE分析,以血清上清蛋白質作為對照,結果如圖3a所示。從圖中可以看出,外泌體的蛋白質輪廓與血清上清有顯著不同。血清中的高豐度蛋白質在外泌體中都明顯減少甚至消失,如70 kDa的血清白蛋白、55和25 kDa的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。同時,外泌體中有許多血清上清中沒有的特征條帶,特別是在相對分子質量高于100 kDa的區域,可能是因為這些外泌體蛋白質攜帶大量的翻譯后修飾[16]。采用液相色譜-質譜對外泌體蛋白質進行定性分析,3次技術重復的結果共鑒定到了179個外泌體蛋白質(見圖3b)。為了分析這些外泌體蛋白質具有的分子功能、參與的生物過程以及在細胞中的定位,本文進行了基因注釋分析(Gene Ontology,GO),如圖3d所示。結果表明,外泌體蛋白質主要參與防御反應、蛋白質激活和免疫應答等生物過程,主要分布在細胞外區域和囊泡中,參與的分子功能主要有蛋白質結合和抗原結合等,這些結果與文獻[17]報道基本一致。綜上所述,血清外泌體具有自身的獨特性,外泌體蛋白質組可以反映生理和病理變化。

圖3 外泌體的蛋白質組學分析Fig.3 Proteomic analysis of serum exosomes a.SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)of exosomes and serum supernatant.Lane M:marker;lane Sup:serum supernatant;lane Exo:exosomes.b.Venn diagram of identified exosomes proteins.c.Venn diagram of exosomes proteins and ExoCarta database.d.Gene Ontology analysis of exosomes proteins.

2.3 血清外泌體蛋白質組在骨質疏松中的應用

進一步將血清外泌體蛋白質組應用于骨質疏松研究。將正常對照組(n=4)、骨量減少組(n=4)和骨質疏松組(n=4)的血清分別混合均勻,并分離富集血清外泌體。采用免標記定量蛋白質組學方法對3組外泌體蛋白質樣品進行比較分析,每個樣品進行3次技術重復。經MaxQuant軟件分析和歸一化,共鑒定到229個蛋白質,其中在正常對照組、骨量減少組和骨質疏松組中分別鑒定到188、224和185個蛋白質(見圖4a)。對鑒定到的229個蛋白質和外泌體數據庫ExoCarta進行了比對,結果顯示有74.5%的蛋白質是外泌體蛋白質(見圖3c)。定量比較分析結果顯示,很多蛋白質在3組之間差異明顯(圖4b)。其中,骨量減少組相對正常對照組有71個上調、9個下調,骨質疏松組相對骨量減少組有5個上調、77個下調,而骨質疏松組相對正常對照組有6個上調、20個下調。

進一步對骨質疏松組和正常對照組之間變化倍數大于2或小于0.5的71個蛋白質進行了信號通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA),結果鑒定到了這些蛋白質參與的10個典型通路(見圖4c),包括整合素信號通路(integrin signaling)和肌動蛋白細胞骨架信號通路(actin cytoskeleton signaling)等。整合素信號通路是維持骨組織動態平衡過程的重要信號通路,可以通過調節骨細胞功能,包括增殖、發育、分化、細胞黏附、遷移和凋亡,參與骨組織的重建和骨平衡的維持[18]。整合素蛋白質還可以通過整合素信號通路來調節絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化來響應流體剪切力,調節成骨細胞的生長[19]。肌動蛋白細胞骨架信號通路以及該信號通路中關鍵蛋白質在骨細胞的生長和骨組織形成過程中扮演著重要角色,參與該信號通路的蛋白質Filamin A、Talin 1和Gelsolin在本研究中也得到質譜鑒定。已有研究表明,通過對成骨細胞中肌動蛋白細胞骨架信號進行抑制,會影響成骨細胞的功能,進而抑制骨組織形成和骨平衡狀態[20]。這些結果表明,在骨質疏松患者血清外泌體中發現的關鍵蛋白質可能和骨量減少密切相關,這些蛋白質參與的信號通路有助于深入研究骨質流失的機制。

按照變化倍數在2倍以上的標準,篩選出在骨質疏松組或骨量減少組中變化顯著的17個蛋白質,包括Integrin β3、Integrin α2β1、Talin 1和Gelsolin等(見表2),并對這些蛋白質進行了蛋白質-蛋白質相互作用分析。結果表明,這些蛋白質之間存在很強的相互作用(見圖4d),它們很可能通過共同協作來行使功能,這也說明骨質疏松患者體內發生了系統性變化。例如,Integrin β3 (ITGB3)是破骨細胞中高表達的一種整合素蛋白質,對于破骨細胞中肌動蛋白環和皺褶膜的形成有著重要作用,是細胞骨架重排和破骨細胞功能活化必不可少的關鍵蛋白質。當Integrin β3信號增強會提高破骨細胞的活力,導致骨量下降并大大增加骨折的風險[21]。此外,Integrin β3蛋白還可以調節其他骨疾病(如骨瘤)中破骨細胞的功能[22],因此Integrin β3對研究骨質疏松癥等骨疾病有著重要的意義。另一個重要的整合素蛋白Integrin α2β1 (ITGA2B),位于破骨細胞的皺褶邊緣,對破骨細胞和骨組織結合能力有重要的作用,當用針對Integrin α2β1的抗體或反義寡核苷酸消耗掉Integrin α2β1后,可以顯著降低破骨細胞的骨吸收能力[23]。Talin 1(TLN1)是一種相對分子質量是270 kDa的細胞溶質吸附蛋白質,可以連接肌動蛋白細胞骨架與整合素蛋白進而調控生物過程。在小鼠模型中,通過抑制Talin 1蛋白質的表達,可以增強破骨細胞對骨組織的吸收,進而導致骨量的下降[24]。這表明Talin 1可以抑制破骨細胞對骨組織的吸收,該蛋白質的研究對今后骨質疏松的診斷和治療具有重要作用。人凝溶膠蛋白(gelsolin,GSN)是凝溶膠蛋白質家族的一種肌動蛋白結合蛋白質,與破骨細胞的生長過程和功能發揮有著密切聯系[25]。已有研究[26]顯示,Gelsolin蛋白在破骨細胞中足體和肌動蛋白環的生成過程起重要作用,進而對破骨細胞骨吸收能力產生影響,引起骨量的變化,有望作為骨質疏松癥診斷的潛在標志物。此外,許多蛋白質在正常對照組、骨量減少組和骨質疏松組中呈現顯著的變化趨勢,或者持續下調,或者先上調再下調,如圖5所示。這些蛋白質與骨量流失的相關性目前尚未見到文獻報道,對這些重要蛋白質的研究有望為研究骨量流失疾病找到新的方向。

圖4 外泌體蛋白質的生物信息學分析Fig.4 Bioinformatics analysis of identified exosomes proteins a.Venn diagram of proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.b.Differentially expressed proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.N:normal;OA:osteopenia;OS:osteoporosis.c.Top 10 pathways enriched by IPA from the proteins that differentially expressed between the osteoporosis and normal groups.d.Protein-protein interaction analysis of 17 candidates.Protein names are the same as those in Table 2.

表2 骨量減少組和骨質疏松組中變化顯著的17個候選蛋白質Table2 Seventeen candidates significantly dysregulated in the osteoporosis and osteopenia groups

Nor:normal.

圖5 候選蛋白質在不同組別的表達趨勢Fig.5 Protein expression trend in different groups a.Resistin,ferritin light chain,and histone H2B type 1-C/E/F/G/I.b.Fibrinogen alpha,gamma,and beta chains.iBAQ:intensity-based absolute quantification.c.Volcano plots from MaxQuant quantitative analysis of exosomes in the osteoporosis and normal groups.Red dot:significantly up-regulated proteins (p<0.05,fold change>2);green dot:significantly down-regulated proteins (p<0.05,fold change<0.5);black dot:no significant difference.FC:fold change.

3 結論

本文對血清外泌體進行了分離分析和表征,對血清外泌體蛋白質組進行了研究,并應用于骨質疏松癥研究。通過定量比較正常對照組、骨量減少組和骨質疏松組在外泌體蛋白質表達上的差異,發現了與骨量流失相關的蛋白質與人體骨平衡和骨細胞的功能密切相關,雖然這些蛋白質有待進一步驗證,但本研究提示血清外泌體蛋白質組有望作為骨質疏松癥診斷和治療的靶標。