植物樣品中內源性植物激素時空分布的研究進展

李玉璇,段春鳳,關亞風

(1.中國科學院分離分析化學重點實驗室,中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連 116023;2.中國科學院大學,北京 100049)

內源性植物激素是植物體自身合成的、控制其生長發育的一類微量或痕量信號分子。內源性植物激素是具有高度活性的小分子化合物,它們參與調控了植物體的整個生長周期,包括植物組織(或器官)的萌發、生長、分化、成熟、衰亡與休眠等過程,幾乎在植物體每個生命過程中都發揮著不可替代的作用[1]。植物激素能夠調節植物對外界刺激(如溫度、損傷、水分等)產生應激反應,在植物體對抗外界脅迫過程中同樣起到重要作用[1,2]。通過調節植物激素在植物體內的代謝過程,可以調控植物的生長發育,提高作物的品質和產量[2]。因此,植物激素的相關研究在分析化學、植物學、農業科學等領域被廣泛關注。

表1 主要植物激素的理化性質及作用Table1 Physical and chemical properties and effects of the main phytohormones

pKa:acidity coefficient;logP:partition coefficient;ABA:abscisic acid;CTKs:cytokinins;GAs:gibberellins;BRs:brassinosteroids;JA:jasmonic acid;SA:salicylic acid;-:no data.

近年來我國研究者在植物激素檢測方面取得了一系列研究成果,大量對植物激素的定性定量分析方法不斷涌現,大大提高了我國在這一領域的技術水平[3-5]。2010年，白玉等[6]綜述了5類植物激素的檢測技術,并指出超微量、高靈敏的準確定性定量方法研究是未來應深入研究的一個方向;閆存玉和褚金芳團隊[7]從提取純化與分析檢測方法方面綜述了植物激素定量分析方法的研究進展;關亞風團隊[8]對植物激素的樣品前處理方法進行了綜述;2017年,陳義團隊[9]以超痕量植物激素檢測為主線綜述了當前植物激素檢測方法學研究的進展。從這些綜述中可以看出我國研究者在痕量植物激素分析方法研究中的貢獻。

植物激素是在植物體內可遷移的有機組分,可以從植物體的產生部位運輸至作用部位,進而調控植物體的生長發育。因此,植物激素在植物體內的時空分布信息是從分子層面探索植物激素調控植物生理生化作用機理的基礎。如何從限量的活體植物樣品中測定痕量甚至超痕量激素的時空變化,是當前內源性植物激素分析的一大挑戰[8]。本文以植物激素的時空分布為主題,綜述了近5年來植物激素在植物體內時空分布測定方法的相關進展,從時空分布研究的難點、分析方法和植物激素時空分布情況等幾個方面進行了簡要總結與討論。

1 常見的植物激素及其分析難點

根據植物激素化學性質及其對植物體作用的不同[1],目前國際上公認將植物激素分為幾大類:生長素(auxins)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、細胞分裂素(cytokinins,CTKs)、赤霉素(gibberellins,GAs)、油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)、乙烯(ethylene,ETH)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)及其衍生物等。常見植物激素的理化性質和作用見表1，結構式見圖1。

圖1 主要植物激素代表物的結構式Fig.1 Structures of main representative phytohormones

不同植物激素在植物體中含量分布不同,通常在ng/g鮮重(FW)甚至pg/g FW數量級水平。生長素、ABA、CTKs、JA、SA在植物體中的含量較高[10,11],通常為1～1 000 ng/g FW;赤霉素含量為0.1～100 ng/g FW,較之含量低3～4個數量級[10];而BRs含量最低,花粉及未成熟的種子中其含量為1～100 ng/g FW,在葉片及葉芽中則低至0.01～0.1 ng/g FW[11]。植物激素通常不穩定,對環境(溫度、光照、pH等)較為敏感,如赤霉素對環境pH值敏感,在偏酸性條件下才可保持較穩定狀態,且當環境溫度高于40 ℃時易產生變化[9,12]。植物激素多數不含可以被高靈敏檢測的基團,且同類別植物激素的化學結構大多相似,存在較多同分異構現象[9]。植物體基質成分組成復雜,生物環境多變,對植物激素的分離檢測造成很大干擾[8],這對植物激素的定量分析提出了更高要求。

若要獲得植物激素的時空分布信息,建立分析方法時將面臨以下幾個難題。

(1)取樣難:時空分布研究往往需要從整株植物樣品中將需要分析的組織器官剝離出來。如何在剝離過程中保持樣品中植物激素的原有水平和分布狀態,盡可能降低甚至消除取樣帶來的誤差,是建立時空分析方法的首要難題。

(2)稱量難:與整株植物平均含量分析不同,空間分布的測定通常僅局限于植物體的某些組織器官,樣品量非常有限,通常在幾十微克至幾毫克水平[4,10]。為獲得準確的樣品質量,需要高精密的天平(十萬分之一甚至百萬分之一天平[8])進行稱量,普通的分析實驗室難以實現。

(3)分析難:由于時空分布研究的樣品量少,待測植物激素的質量僅在pg甚至fg數量級,這種超痕量分析對分析方法的靈敏度是一個嚴峻挑戰。

2 植物激素的時空分布分析方法進展

2.1 取樣方法

植物激素的測定通常為離體或體外分析。為了使植物樣品最大限度地保持其原始激素水平,通常在采摘后用液氮將樣品迅速冷凍[13-16]。液氮冷凍后的樣品可以儲存于-80 ℃冰箱中,待要進行樣品前處理時再取出。這是目前植物激素測定的主流取樣方法。而對于植物激素的時空分布測定,取樣過程通常需要對植物樣品的組織器官進行剝離,由此造成的損傷很可能會使植物體產生應激反應而導致植物激素水平的變化。Pan等[17]測定研究了擬南芥葉片受機械損傷后其多種植物激素的含量變化情況,發現機械損傷對JA、ABA、SA等激素的影響較大,而GAs、ZT、IAA等激素對機械損傷不敏感(見表2)。褚金芳課題組[18]對于水稻受傷葉片中6種內源性植物激素含量進行定量測定,同樣發現機械損傷會對ABA、JA植物激素產生影響,而IAA、吲哚-3-丙酸(IPA)、IBA幾種植物激素對機械損傷不敏感。因此,測定對機械損傷不敏感的激素時,可以在常溫下對新鮮植物樣品進行器官剝離或切割取樣。2002年,Muller等[19]采用手術刀片在常溫下對擬南芥葉片進行切割,分析其中包括IAA等酸性植物激素的分布情況。本課題組[10]此前在室溫下將單片擬南芥葉片切割成15個小片,以此測定赤霉素的含量分布。而對于那些對機械損傷敏感的激素,則應采用先“固定”后取樣的方案,即先采用液氮冷凍，固定激素后進行敲擊剝離[4,14]植物組織器官。例如,Meulebroek等[20]在液氮環境下處理番茄葉片組織,測定其中ABA、JA、SA等8種植物激素。然而這一方法是否可以有效減少機械損傷帶來的影響還有待考察。另外,對于除葉片以外的其他植物組織器官中植物激素含量受機械損傷的影響情況是否與葉片一致也需要進一步研究。

表2 損傷誘導擬南芥葉片中植物激素1 h內的變化[17]Table2 Wound-induced changes of phytohormones in Arabidopsis leaf in1 h[17]

-:no significant changes;↑:content increase;MeBA:benzoic acid methyl ester;MeCA:cinnamic acid methyl ester.

2.2 樣品前處理

植物激素的時空分布測定是對微量樣品的超痕量分析,存在樣品量少、準確稱量困難、基質干擾嚴重等特點,對樣品前處理和儀器分析方法都提出了更高的要求。當儀器分析方法的靈敏度不足以進行單個組織器官的分析時,常常需要通過增加樣本量來彌補,如從多個植株中采摘相同的組織器官合并成一個樣本[21,22],這種方法測定的結果為多個植株的平均值,植株的個體差異會被掩蓋,影響分析結論的準確性。近年來,國內外研究人員從提取效率、除雜方法、化學衍生等方面不斷提高分析方法的靈敏度,開發出更為高效的樣品前處理方法,實現了單個組織器官的植物激素測定[4,10,14]。表3匯總了近年來植物激素時空分布研究中使用的樣品前處理方法。

對于微克至亞毫克樣品的稱重,普通的萬分之一天平已經難以勝任。在缺乏更高精度天平的情況下,一般只能獲得樣品(某種組織器官)的平均重量,即稱量多個相同的組織器官,計算單個樣品重量的平均值[9]。

對于如此微量的植物樣品,提高樣品利用率是前處理過程的關鍵。目前,將植物樣品在液氮環境下研磨后過夜(～12 h)浸提仍是植物激素分析中最常用的前處理步驟,通常采用甲醇、乙腈等作為萃取溶劑。然后采用液-液萃取或固相萃取等方式進行二次萃取、富集與除雜凈化。例如,Xin等[26]采用95%(v/v)甲醇水溶液浸提,經SPE凈化后,進行衍生后進樣分析。目前固相萃取主要采用的吸附劑包括十八烷基鍵合相硅膠(C18)、辛基鍵合相硅膠(C8)、混合型強陰離子交換材料(MAX)、混合型強陽離子交換材料(MCX)和親水-親油平衡聚合物材料(HLB)等填料。

表3 近期植物激素時空分布研究中的樣品前處理方法總結Table3 Summary of sample preparation method for the recent research on spatial-temporal distribution of phytohormones

FW:fresh weight;HF-LLLME:hollow fiber-liquid-liquid-liquid micro-extraction;MSPE:magnetic solid phase extraction;on-line 2DμSPE-ODO:on-line two-dimensional microscale SPE-on column derivatization;MSPD:matrix solid phase dispersion;* without overnight liquid extraction process;LLE:liquid-liquid extraction;/:without other extraction and purification steps except for overnight liquid extraction;DMSPE:dispersive matrix solid phase extraction;-:with many plant organs as the sample for determination;√:with single plant organ as the sample for determination;MPyBA:6-methoxy-3-pyridinylboronic acid;m-APBA:m-aminophenylboronic acid;EDC:N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide;BPTAB:3-bromopropyltrimethylammonium bromide;AYBA:N-(acridin-9-yl)-2-bromoacetamide;DEED:N,N-diethyl ethylenediamine;2-methyl-4-PAMBA:2-methyl-4-phenylaminomethyl-benzeneboronic acid;BTBA:4-borono-N,N,N-trimethylbenzenaminium iodide.

由于植物樣品為固體,可以采用基質分散固相萃取的方式處理微量植物樣品,即在液氮環境下研磨樣品,而后利用SPE或分散固相萃取等方法進行凈化。本課題組[21]為縮短樣品前處理時間避免過夜浸提,采用了MSPD-串聯SPE(MSPD-MAX-MCX)的方法實現了對水稻樣品中6種BRs的測定,對比傳統LLE方法,有效提高了BRs的回收率,但方法樣品轉移步驟較多且前處理時間較長(>1 h)。在此基礎上,本課題組[10]開發了一種微型化MSPD方法,實現了在亞毫克樣品中對GAs的檢測。將樣品置于微型離心管中于液氮環境下采用C18分散劑研磨,加入乙腈萃取后離心處理,大大減少了前處理時間(<1 h),且集提取凈化于同一離心管內,處理過程中無樣品轉移,降低了樣品損失,這對于微量樣品的處理是十分有利的。而對于BRs的檢測,僅僅使用C18處理無法滿足對BRs測定的基質凈化,故本課題組[15]在微型化MSPD的基礎上加入MAX-MCX進一步凈化,并發現不同復雜程度的樣品基質,其最佳的分析步驟不同。這種結合了MSPD和dSPE的方法暫命名為分散基質固相萃取,它避免了傳統MSPD方法中轉移樣品-吸附劑混合物填裝SPE柱的過程,可以降低樣品轉移帶來的損失。

為了提高微量樣品中痕量植物激素檢測的靈敏度,在現有的儀器條件下,采用化學衍生是目前最有效的手段。在使用MS作為檢測器時,化學衍生可以有效地提高離子化效率從而提高質譜的檢測靈敏度。對于常見的幾類植物激素的測定,尤其是在測定植物樣品中含量極低且在MS分析中低電離效率的GAs和BRs時,通常需要在進樣分析前進行衍生化處理從而提高靈敏度。在時空分布的測定中,Xiao等[25]運用計算化學設計一種新型的衍生試劑N-(吖啶-9-基)-2-溴乙酰胺進一步提高羧酸類植物激素的衍生效果;Li等[4]將在乙醇環境中的N-(3-二甲基丙基)-N′-乙基碳二亞胺作為GAs的衍生試劑,實現了同時對單、雙羧基的GAs的衍生,有效提高了GAs的測定靈敏度;本課題組[10]采用新型衍生試劑3-溴丙基三甲基溴化銨對GAs進行衍生,可將其MS靈敏度提高560～7 600倍,且最低可衍生水平達到1 pg/mL(～1 fg/mg),同時將BPTAB試劑與此前報道的2-溴乙基三甲基溴化銨(BETA)[27]及3-溴丙酮基三甲基溴化銨(BTA)[28]兩種試劑的衍生效果進行對比,發現采用BPTAB試劑時靈敏度更高;對于BRs的衍生,本課題組[13]設計開發了一種碘化4-二羥基硼基-N,N,N-三甲基苯胺衍生試劑用于BRs化學衍生反應,將BRs的檢測靈敏度提高了1 100～448 700倍;Cai等[14]采用N,N-二乙基乙二胺與2-甲基-4-苯基氨基甲基-苯硼酸兩種衍生試劑用于CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs的衍生化反應,實現了同時衍生處理包括BRs在內的31種植物激素。

2.3 檢測方法

基于LC的高效分離能力與MS或MS/MS的高選擇性和高靈敏度,LC-MS或LC-MS/MS已經成為目前植物激素分析的主流檢測方法。其中MRM模式更為同時檢測多種植物激素提供了便利,成為目前植物激素定量分析的首選。但是,當前植物激素標準樣品的種類較少,能獲得同位素標記的標準樣品種類更少。為了提高現有質譜檢測植物激素的可靠性,開展相關標準樣品制備技術的研究是十分必要的。目前,馮鈺錡團隊[29,30]通過穩定同位素標記的衍生試劑衍生植物激素標準品,以其作為內標物,可以部分解決同位素內標難以獲得的問題。

需要說明的是,除了本文提到的取樣-前處理-色譜-質譜分離檢測方案外,植物學家還通過測定與植物激素生物合成或代謝相關酶的基因表達產物,來間接獲取植物激素的時空分布信息。但是這種方法很難做到同時監測多種植物激素,且通過基因表達產物無法準確獲得某種激素的濃度信息。

另一方面,在植物激素的時空分布研究中成像技術也有相關的應用,如熒光成像[31]、質譜成像[32,33]等。但成像分析的局限性比較明顯,比如熒光成像需要將熒光標記物引入植物體內,這個操作很可能引起植物的應激反應而產生激素水平的變化,因此反映出的濃度難以代表內源性激素的真實值。質譜成像一般只能檢測植物樣品表面,對于植物體內部的激素,需要切片等操作,會對植物體造成機械損傷;而且其使用的離子化手段對植物體的影響尚不清晰。因此,本文不對植物激素的成像分析展開更深入的討論。

3 植物激素的時空分布研究

3.1 不同生長期含量變化的研究

對于植物激素在植物體內隨時間變化的研究,尤其是不同生長期的植物激素的檢測,可以通過采集多顆植物樣品而獲得較大的樣品量。王澤文等[34]采用SPE與HPLC-MS/MS結合的方法測定了IAA、IBA、ABA、ZT等4種植物激素在海帶薄嫩期、厚成期及成熟期的含量,發現ZT與ABA在成熟期含量最高,IAA在薄嫩期最高,而IBA含量最高出現在厚成期。Cai等[22]采用dSPE-UPLC-MS/MS方法測定了水稻在不同生長時期包括生長素、ABA、CTKs、JA、SA、GAs等54種植物激素的含量變化。Xiao等[26]采用LLE-UPLC-MS/MS監測了28 ℃溫度下IAA、JA、ABA在單顆水稻種子萌發期的72 h中的含量變化,發現在種子的胚中IAA的含量在0～12 h間迅速增加,達到峰值后略有減少;ABA自萌發開始后12 h內含量急劇減少而后趨于平穩;而JA含量在萌發期緩慢增加并在60 h后趨于穩定。Li等[4]通過LLE-UPLC-MS/MS在對擬南芥花器官不同花期(花期13～15)中18種GAs含量的研究中發現,GAs含量隨花期呈現出不同增減規律,如隨著花期的發展沿活性GA4代謝路徑中的GAs含量會有所增加。Cai等[14]采用過夜浸提結合UPLC-MS/MS定量分析了CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs中12種植物激素在擬南芥花期13和15中的含量(見圖2),樣品量為0.02～5 mg,是目前報道的最少用量。本課題組[21]采用MSPD-串聯SPE-HPLC-MS/MS測定孕穗期和成熟期水稻葉片中的BRs,發現在不同生長階段水稻BRs具有明顯的差異性,其中在孕穗期樣品中扁豆甾酮(DS)含量明顯高于其他幾種,從孕穗期到成熟期24-表油菜素內酯的含量在增加,而DS含量明顯減少。

圖2 花期13和15時擬南芥的(a)花器官和(b)花藥、雌蕊中內源性植物激素的含量[14]Fig.2 (a)Floral organs and(b)contents of endogenous phytohormones in anther and pistil of Arabidopsis thaliana against floral stages13 and15[14]

3.2 空間及地域差異的研究

近年來在植物體的細胞、組織、器官水平上均有相關的研究工作。在植物細胞水平上,Jiskrová等[35]選取了單子葉植物擬南芥葉片和雙子葉植物大麥兩種模式植物的葉片細胞,采用SPE及微型SPE方法結合UPLC-MS/MS測定了CTKs除液泡外細胞內、液泡內以及細胞外間隙的空間分布,發現絕大多數CTKs分布在細胞外間隙中。在植物組織水平上,賈鵬禹等[36]通過在線SPE-HPLC-MS/MS方法測定了大豆葉片、莢皮、籽粒中IAA、ABA、ZT、GA3的含量,發現籽粒中ABA含量明顯較高;張莉等[37]采用LLE-HPLC-UV方法探索了楊樹枝條的尖梢、基部、上端IAA、ABA、GA、ZR等4種植物激素與枝條分枝角度發育的關系;本課題組[10]利用微型MSPD-UPLC-MS/MS方法測定擬南芥單片葉子上8種GAs的空間分布(空間分辨率為2×2 mm,樣本質量0.3～0.8 mg),發現GA19的含量在單片擬南芥葉上呈現差異分布,葉柄處含量最高(見圖3)。在植物的器官水平上,Li等[4]在低溫下剝離擬南芥花器官(雄蕊、雌蕊、花瓣、萼片及花托),并采用LLE結合UPLC-MS/MS測定其中GAs的空間分布,發現不同植物激素在不同花器官中存在明顯的差異性,如在雌蕊中GA19大量出現,疑似為GA19的合成位點;Cai等[14]采用UPLC-MS/MS檢測CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs的31種植物激素并定量分析其中的12種在擬南芥單花不同生殖器官中的分布;Xin等[26]采用MSPE-UPLC-MS/MS測定了BRs在擬南芥和水稻莖、葉、穗等不同器官的含量分布,探索了BRs與水稻表型的關系。

在地域差異的測定中,本課題組[15]利用DMSPE-HPLC-MS/MS測定對比了長江流域不同省份甘藍型油菜籽中5種內源性BRs。結果表明:不同油菜素甾醇含量具有差異,其中6-脫氧-24-表油菜素甾酮含量最高且明顯高于其他4種;不同省份選取的樣品中,d-epiCS含量呈現差異性,其中湖北省的樣品中其含量最高(見圖4)。

4 結論與展望

近年來,內源性植物激素的時空分布研究取得了很大進步,但仍存在不少技術難題,對活體植物中多種植物激素的原位、實時、高分辨率檢測仍未突破。目前,主流的時空分布研究仍采用活體取樣-離體樣品前處理-色譜-質譜分析策略,取樣方式的有效性有待進一步確認;液氮研磨、長時間浸提等前處理過程限制了植物激素動態檢測的時間分辨率;而空間分辨率則受取樣方法、稱量精度和方法靈敏度等多因素影響。另一方面,植物激素調控植物生長發育的生理機制并非單一的,而是多類激素協同作用的結果。單類激素的時空分布信息不足以反映激素調控植物生理過程的全貌。因此,當前植物激素的時空分布測定技術離植物學研究的前沿需求仍有很大差距。

筆者認為,以下幾個方面可能成為該領域未來發展的主要方向。

圖3 單片擬南芥葉上GAs的空間分布[10]Fig.3 Spatial distribution of GAs in an Arabidopsis thaliana leaf[10] a-c.contents of (a)GA4,(b)GA8 and (c)GA19 in different leaf disc (position was marked in Fig.3d)of a Arabidopsis thaliana leaf;d.spatial distribution of GA19 within a single Arabidopsis thaliana leaf.

圖4 長江流域不同省份甘藍型油菜籽中5種內源性油菜素甾醇的地域分布[15]Fig.4 Geographical distribution of five endogenous BRs of Brassica napus L.oilseed rape originated from different provinces in Yangtze River basin[15]

多種類植物激素的時空分布研究:目前大多數時空分布研究尤其是空間分布研究仍集中在單一種類的植物激素,為獲得更全面的激素“地圖”信息,有必要開發同時測定多種類植物激素的分析方法,實現多種類植物激素的時空分布測定。

無損、原位植物激素分析方法:在活體植物上進行無損、原位植物激素分析可以避免取樣、樣品前處理帶來的不確定因素,獲得最直接的激素含量和分布數據。目前,任何一種成像技術都無法完全滿足植物激素時空分布研究的需求,質譜成像、光學成像具有良好的發展前景;一些原位、活體前處理方法也具有很大的發展潛力。

低等植物中植物激素的時空分布研究:伴隨著植物激素測定方法的不斷發展,植物學家對植物激素生理作用的關注已從陸生高等植物逐漸擴展到低等植物,如微藻[38]等;目前,對低等植物中植物激素的研究報道遠少于高等植物,低等植物中多種類激素的協同作用及時空分布情況才剛起步,植物激素在低等植物與高等植物中的含量與作用差異有助于植物進化學的研究。

總而言之,原位、實時、高分辨、動態監測植物體內的痕量植物激素仍是非常具有挑戰性的研究課題,也給分析科學的發展提供了較多機會。