SNAP-tag蛋白標簽技術與熒光分析法在蛋白原位分析中的聯合應用

喬慶龍,周 偉,陳 婕,劉文娟,苗 露,尹文婷,徐兆超

(中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連 116023)

蛋白是生命科學領域最重要的研究對象,參與多種生命過程中所必需的信號轉導,其功能通過與小分子、DNA、其他蛋白底物之間相互作用實現[1,2]。因此,對蛋白的原位分析,包括蛋白識別、蛋白分布及實時動態追蹤等,能夠更真實地揭示蛋白在生理過程中發揮的作用。然而,紫外吸收法、圓二色光譜法、電化學法、紅外光譜法、核磁共振法等均很難實現活細胞及活體內蛋白的原位分析[3]。

基于有機小分子的熒光分析法能夠在不破壞原生環境下對蛋白進行監測。相比于傳統基于熒光蛋白的分析法[4-6],有機小分子具有分子結構簡單、顏色可選擇多、易改造等優點,因此其在蛋白識別、標記領域逐漸成為熒光蛋白的替代者[7-10]。然而,有機小分子染料通常源于人工合成,無法像熒光蛋白一樣由細胞內源產生。這就為小分子應用于蛋白原位分析中帶來了諸多問題:如有機小分子熒光染料在細胞中分布不均勻,易產生非特異性標記,細胞毒性大等。其中,有機小分子的非特異性標記問題尤為突出,科研工作者無法像熒光蛋白分析法一樣控制目標蛋白上連接有機小分子的數量及位置。因此,這引發化學家去開發新的生物正交方法,并基于生物正交的方式將小分子染料定點、共價連接到目標蛋白上,進一步通過熒光信息跟蹤、研究目標蛋白的位置和功能。目前應用最廣泛的生物正交方式是基于酶促反應的蛋白標簽技術,如SNAP-tag、Halo-tag、PYP(Photoactive yellow protein)-tag等。SNAP-tag標簽蛋白是人源DNA修復蛋白的O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶(hAGT)的突變體[11,12],能夠快速、特異性地與芐基鳥嘌呤(BG)或芐基氯嘧啶(CP)的衍生物反應,進而使SNAP-tag蛋白與有機小分子之間形成穩定的硫醚鍵,融合有SNAP-tag的目標蛋白能夠特異性地連接一個探針分子。

目前,基于SNAP-tag技術與小分子熒光染料已開發出多種商業的SNAP-tag熒光探針,該類熒光探針通常由環境不敏感的熒光團(如:羅丹明、花菁染料、熒光素等)與芐基鳥嘌呤兩部分構成。雖然,這類探針與SNAP-tag標簽蛋白能夠達到很高的反應速率,但是反應前后熒光信號變化通常較小(增強1～2倍)。因此,這類探針在對細胞著色后存在較高的熒光背景,需要多次洗滌以除去未反應或非特異性標記的分子,才能達到高的信噪比。細胞的洗滌往往會造成時間分辨率的降低,對于蛋白動力學分析帶來不利。因此,開發增強型的SNAP-tag熒光探針(即與SNAP-tag標簽蛋白結合后熒光信號明顯增強)顯得尤為迫切。環境敏感型染料能夠通過熒光信號的變化對分子周圍環境微小改變進行快速、靈敏的響應(通常水中熒光量子產率很低),因此這類染料逐漸被應用于SNAP-tag探針的設計中。通常這類探針由水環境中到SNAP-tag較為疏水的蛋白表面或空腔后,熒光信號會明顯增強,從而達到免洗的效果[13-15]。Tan課題組[16-18]以環境敏感型染料(4-磺酰胺基-7-氨基苯并惡二唑,SBD)為發光基團,設計合成了用于活細胞內免洗熒光成像的SNAP-tag探針BGSBD。與SNAP-tag結合后其熒光增強約280倍,實現了活細胞內原位蛋白的熒光成像,但是該探針的絕對亮度較低,不能滿足超分辨熒光成像需求。針對以上問題,本研究基于傳統的環境敏感型熒光染料萘酰亞胺,結合SNAP-tag蛋白標記技術設計合成免洗的用于蛋白原位分析的熒光探針[19-21];同時,通過芐基鳥嘌呤的位置選擇提高探針信噪比、選擇性及反應速率,以滿足不同實驗方案及領域對識別與標記效果的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

核磁共振氫譜(1H NMR)在Bruker (AVANCE III 400/101MHz)波譜儀上測試得到,其中以0.03%(v/v)的四甲基硅烷作為基準物質。紫外/可見吸收光譜與熒光發射光譜分別在Agilent Cary 60 UV-Vis分光光度計及Agilent CARY Eclipse熒光光譜儀上測得。溶劑pH在Sartorius PB-10的pH計上測得。生物細胞成像則在Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡上測得,其中鏡頭選取100倍油鏡(NA=1.40)。

分子合成所使用試劑為國產(伊諾凱公司和百靈威公司)或進口(Sigma-Aldrich公司)試劑,未經特殊說明外,均為分析純,直接使用。商業化染料細胞核染料Hoechst 33342與線粒體商業染料MitoTracker Red均購自凱基生物公司。柱色譜分離純化用硅膠粉型號為200～300目(伊諾凱公司)。生物測試用商業化亞細胞器標記染料(美國Life Technologies公司)。生物細胞培養所需的DMEM及1640培養基、青鏈霉素(美國Hyclone公司);優質胎牛血清(以色列Biological Industries)。

1.2 探針合成

1.2.1探針BGAN-Amino的合成

依次稱取4-氨基-N-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-1,8-萘酰亞胺(AN-Amino)(30 mg,0.09 mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氫吡咯氨基嘌呤氯鹽(BG+)(81 mg,0.27 mmol)和叔丁醇鉀(70 mg,0.54 mmol)溶于5 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,在氮氣氛圍保護下室溫攪拌10 h后停止反應(見圖1)。減壓除去DMF,粗產物經硅膠柱分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,15∶1,v/v),通過薄層色譜板監測產物流出,所得產物減壓除去溶劑得黃色粉末26 mg,產率62%。

1.2.2探針mBGAN-2C的合成

依次稱取4-乙氨基-N-(3-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-1,8-萘酰亞胺(mAN-2C)(50 mg,0.14 mmol)、BG+(105 mg,0.41 mmol)和叔丁醇鉀(90 mg,0.80 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中,在氮氣氛圍保護下室溫攪拌3 h后停止反應(見圖2)。減壓除去DMF,粗產物經硅膠柱(200～300目)分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,20∶1,v/v),通過薄層色譜板監測產物流出,所得產物減壓除去溶劑得黃色粉末33 mg,產率48%。

1.2.3探針4BGAN-Bu的合成

依次稱取4-(4-(O-2-氨基嘌呤)基甲基)芐基-N-丁基-1,8-萘酰亞胺(4AN-Bu)(100 mg,0.26 mmol)、BG+(197 mg,0.77 mmol)和叔丁醇鉀(175 mg,1.56 mmol)溶于5 mL干燥的DMF中,在氮氣氛圍保護下室溫攪拌10 h后停止反應(見圖3)。減壓除去DMF,粗產物經硅膠柱分離純化(洗脫劑為二氯甲烷-甲醇,15∶1,v/v),通過薄層色譜板監測產物流出,所得產物減壓除去溶劑得到黃色粉末26 mg,產率19%。

圖1 探針BGAN-Amino的合成Fig.1 Synthesis of BGAN-Amino t-BuOK:potassium tert-butoxide;DMF:N,N-dimethylformamide.

圖2 探針mBGAN-2C的合成Fig.2 Synthesis of mBGAN-2C

圖3 探針4BGAN-Bu的合成Fig.3 Synthesis of4BGAN-Bu

1.3 探針的紫外吸收與熒光發射光譜測試

準確稱取待測探針化合物溶于色譜純二甲基亞砜(DMSO)溶液中配制成2 mmol/L測試母液。準確量取一定體積的母液加入到測試體系中以配制成所需測試濃度(1～10 μmol/L)(其中DMSO所占體積分數小于0.5%)進行吸收與熒光發射光譜的測定。

分別取2.5 μL探針母液加入1 mL磷酸緩沖液中(PBS,20 mmol/L,pH 7.4)配制為5 μmol/L的測試液進行吸收及熒光發射光譜測試,DMSO含量為0.25%(v/v);而后向上述測試液中分別加入20 μL SNAP-tag蛋白溶液(250 μmol/L的PBS溶液,20 mmol/L,pH 7.4)并反應30 min后進行吸收及熒光發射光譜測試。以上熒光光譜采集均選用440 nm激發,狹縫為5-5;控制測試溫度為37 ℃。

1.4 細胞培養及其熒光成像

細胞選用DMEM培養基(其中加入青霉素或者鏈霉素和10%胎牛血清(FBS))進行培育。對對數期HeLa細胞進行消化處理后接種于共聚焦專用皿(MatTek,半徑20 mm)中,于37 ℃、5% CO2下孵育24～48 h。而后將所需質粒與Lip3000分別加入無血清培養基中,混合5～10 min后加入細胞培養皿,繼續孵育24～48 h后,取適量待測化合物母液加入培養基中(根據需要選擇合適終濃度)置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察(鏡頭選用100倍油鏡)。激光為405 nm,熒光采集為420～470 nm;激光為488 nm,熒光采集為500～550 nm;激光為561 nm,熒光采集為580～653 nm。

2 結果與討論

2.1 探針的核磁共振表征

探針BGAN-Amino核磁氫譜數據為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.41 (s,1H),8.64 (d,J=8.3 Hz,1H),8.45 (d,J=6.8 Hz,de 1H),8.22 (d,J=8.4 Hz,1H),7.79 (s,1H),7.70～7.61 (m,1H),7.51 (s,2H),7.43 (d,J=8.1 Hz,2H),7.34 (d,J=8.1 Hz,2H),6.86 (d,J=8.4 Hz,1H),6.27 (s,2H),5.43 (s,2H),5.23 (s,2H)。

探針mBGAN-2C核磁氫譜數據為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.42 (s,1H),8.69 (t,J=15.8 Hz,1H),8.44 (d,J=7.2 Hz,1H),8.25 (dd,J=28.3,8.6 Hz,1H),7.78 (t,J=16.4 Hz,2H),7.66 (dd,J=17.9,9.8 Hz,1H),7.45 (d,J=27.3 Hz,1H),7.32 (dt,J=16.0,7.8 Hz,2H),6.77 (d,J=8.7 Hz,1H),6.28 (s,2H),5.44 (s,2H),5.24 (s,2H),3.43 (dd,J=11.6,5.9 Hz,2H),1.39～1.21 (m,3H)。

探針4BGAN-Bu核磁氫譜數據為:1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ12.42 (s,1H),8.78 (d,J=8.3 Hz,1H),8.52～8.46 (m,1H),8.46 (d,J=7.2 Hz,1H),8.18 (d,J=8.5 Hz,1H),7.83 (s,1H),7.76～7.67 (m,1H),7.49 (d,J=8.2 Hz,2H),7.43 (d,J=8.1 Hz,2H),6.67 (d,J=8.6 Hz,1H),6.27 (s,2H),5.45 (s,2H),4.68 (d,J=5.8 Hz,2H),4.05～3.96 (m,2H),1.57 (dt,J=14.8,7.5 Hz,2H),1.35～1.27 (m,2H),0.91 (t,J=7.3 Hz,3H)。

經檢測,以上核磁數據與各探針結構相符,探針結構正確。

2.2 探針對SNAP-tag標簽蛋白的熒光響應

圖4 不同SNAP-tag探針與蛋白結合前后的熒光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of different probes in the absence and presence of SNAP-tag

基于環境敏感的萘酰亞胺熒光團,在萘酰亞胺母體不同位置引入芐基鳥嘌呤基團,有望得到與SNAP-tag結合效果不同的熒光探針。通過萘酰亞胺內酰胺引入芐基鳥嘌呤基團,并調節嘌呤在苯環的取代位置得到BGAN-Amino與mBGAN-2C;在萘酰亞胺4-位引入芐基鳥嘌呤基團得到探針4BGAN-Bu。終濃度為5 μmol/L的BGAN-Amino、mBGAN-2C、4BGAN-Bu分別與5 μmol/L SNAP-tag蛋白結合后熒光信號均得到了增強,但增強倍數不一(見圖4)。BGAN-Amino與SNAP-tag結合后熒光強度增強約9倍,而mBGAN-2C、4BGAN-Bu分別只有2倍與3倍。探針熒光強度的增加主要來源于SNAP-tag標簽蛋白表面的疏水作用與熒光淬滅基團鳥嘌呤的離去;熒光波長的變化源于探針由水環境(20 mmol/L PBS,pH 7.4)到SNAP-tag標簽蛋白疏水空腔的變化。相比于BGAN-Amino,mBGAN-2C與4BGAN-Bu熒光增強倍數少的原因為二者在PBS(磷酸緩沖液,20 mmol/L,pH 7.4)中熒光強度高,即熒光背景強。以上數據說明本論文中的探針與SNAP-tag標簽蛋白結合后,蛋白空腔或表面的疏水作用給萘酰亞胺母體帶來了較好的熒光增強效果,其能夠作為免洗的SNAP-tag探針用于生物原位成像及蛋白的原位分析中。4BGAN-Bu探針具有較好的細胞相容性及染色速度,因此該探針被進一步用于活細胞內蛋白的原位分析及熒光成像。

2.3 探針4BGAN-Bu在活細胞內對細胞核內H2B蛋白的原位監測

在體外4BGAN-Bu能夠對SNAP-rag蛋白進行特異性識別,且熒光得到明顯增強,但其能否應對復雜生物環境中特異標記目標蛋白仍需進一步考究。首先,對HeLa細胞進行瞬時轉染以表達融合有SNAP-tag的核內蛋白H2B。終濃度1 μmol/L 的4BGAN-Bu細胞培養液在37 ℃孵育HeLa細胞30 min后通過共聚焦熒光顯微鏡對目標蛋白進行熒光分析。圖5a表明4BGAN-Bu能對細胞核內融合有SNAP-tag的H2B蛋白進行染色,細胞核輪廓清晰,無需洗滌細胞。4BGAN-Bu標記的H2B蛋白與商品化Hoechst 33342標記的DNA結構能夠很好重合(見圖5b、5c),這間接證明了H2B蛋白存在染色體內并與DNA雙鏈有較強結合。此外,圖5d中對細胞內熒光強度分析表明,4BGAN-Bu對H2B染色的信噪比較高,具有很好的免洗熒光成像效果。

2.4 探針4BGAN-Bu在活細胞內對線粒體中Cox8A(細胞色素C氧化酶)的原位監測

細胞色素C氧化酶是線粒體內電子傳遞鏈中的末端酶,其動態分布、功能的行使與細胞的代謝密切相關。然而,由于時間分辨與空間分辨率的限制,質譜、圓二色光譜等分析手段在原位監測細胞色素C氧化酶的動態行為上存在較大困難。而通過轉染融合有SNAP-tag蛋白的Cox8A,可以借助探針4BGAN-Bu達到對Cox8A的實時跟蹤。圖6a中標記有4BGAN-Bu的Cox8A在線粒體中分布均勻,線粒體清晰可見且呈線條型(見圖6b)。圖6c-e表明,4BGAN-Bu與商業線粒體染料能夠實現共定位,且SNAP-tag結合后有較高信噪比。4BGAN-Bu能夠在染色后直接用于對Cox8A的原位監測,避免反復洗滌細胞過程中對細胞的細微損傷。

圖5 HeLa細胞的共聚焦成像圖Fig.5 Confocal images of HeLa cells a.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;b.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye Hoechst 33342;c.Live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and Hoechst 33342;d.Intensity profile of regions of interest (ROI)across HeLa cells.

圖6 HeLa細胞的共聚焦成像圖Fig.6 Confocal images of HeLa cells a,b.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;c.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red;d.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red;e.intensity profile of regions of interest (ROI)across HeLa cells.

2.5 線粒體損傷過程中探針4BGAN-Bu對Cox8A(細胞色素C氧化酶)的原位監測

借助探針4BGAN-Bu的免洗及高特異性,進一步考察了線粒體受到損傷后線粒體形態變化及Cox8A分布變化(見圖7a)。高強度激光照射后,線粒體逐漸由線型(見圖6b)變為棒狀或圓形(見圖7b),而Cox8A仍然精準定位線粒體內。實驗表明,借助有機小分子探針4BGAN-Bu與SNAP-tag融合蛋白可以實現對活細胞內不同狀態下的細胞色素C氧化酶Cox8A的實時監測。

圖7 損傷的HeLa細胞的共聚焦成像圖Fig.7 Confocal images of injured HeLa cells a,b.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu;c.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with commercial dye MitoTracker Red;d.live cell imaging of unwashed HeLa cells labeled with 4BGAN-Bu and MitoTracker Red.

3 結論

本研究通過對芐基鳥嘌呤基團連接位置的改造設計了一系列基于萘酰亞胺的SNAP-tag探針,達到了對SNAP-tag不同的識別效果。該系列探針對融合有SNAP-tag的目標蛋白進行了特異性識別,其中BGAN-Amino與SNAP-tag結合后熒光增強了9倍,4BGAN-Bu具有較高反應速率。此外,此系列SNAP-tag探針能夠針對目標蛋白實現活細胞內的免洗熒光成像,對原位分析目標蛋白的動態變化及功能的行使具有重要意義。