除膻菌株的功能性分析

李秋桐，蘇偉，母應春

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

膻味是羊肉具有的一種不良風味，人們對羊肉的膻味進行了大量研究，發現這種特征風味物質主要來源于羊肉的脂肪組織[1]。8 個～10 個碳原子的不飽和脂肪酸對羊肉的風味影響很大，尤其是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸是形成羊肉膻味的主要脂肪酸[2]。微生物除膻是一種較好的除膻方法，通過將菌株接種到羊肉中，微生物產生的脂肪酶與羊肉中的脂肪酸產生作用，對羊肉的風味起到改善作用，一定程度上降低了羊肉的膻味[3]。傳統的方法中，采用添加橄欖油和指示劑的平板對脂肪酶產生菌進行分離篩選。通過對培養基進行改良，將橄欖油替換成羊油，將乳化后的羊油和熒光指示劑加入到篩選平板中，篩選出4 株能酶解羊油的霉菌，經鑒定分別為微孢根霉（Rhizopus microsporus），米根霉（Rhizopus oryzae），米曲霉（Aspergillus oryzae）和多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）。并通過液態發酵試驗，發現這4 株霉菌對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸均具有降解作用，可以用于羊肉除膻。

在菌種發酵的過程中，一些微生物會產生H2S、生物胺，賦予產品不好的感官品質[4-5]。H2S 是一種急性劇毒，吸入少量高濃度的H2S 即可使人于短時間內致命，即使是低濃度的H2S 也會對眼睛、呼吸系統及中樞神經造成影響[6]。人體攝入過量的生物胺會引起中毒，表現出頭疼、心悸、嘔吐、血壓變化和呼吸紊亂等嚴重反應，除此之外尸胺、腐胺、精胺和亞精胺等與亞硝酸鹽反應能產生致癌物質亞硝基胺[7]。發酵肉制品在制作過程中，大都會添加一定量的食鹽和亞硝酸鹽，起到調味和防腐的雙重功效。當食鹽及亞硝酸鹽達到一定濃度時，會對微生物產生透脅迫及毒性作用，使微生物受到抑制甚至死亡[8]。因此篩選出的菌株應對鹽類具有一定的耐受能力。

本試驗對分離篩選出的4 株霉菌進行功能性分析，包括脂肪酶活性的測定、產H2S 測定試驗、產生物胺測定試驗和抑菌試驗，并對其耐鹽性、耐硝酸鹽性及生長曲線進行測定，進一步篩選出合適的菌株進行拮抗試驗和復配試驗，為后續菌株應用于羊肉發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微孢根霉（Rhizopus microsporus）TZH1、米根霉（Rhizopus oryzae）TZH3、米曲霉 （Aspergillus oryzae）TZH4、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）4QT3、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：貴州大學畜產品加工實驗室。

NaOH、酚酞（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；橄欖油（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Na2HPO4·12H2O、FeCl2（分析純）：天津市光復精細化工研究所；KH2PO4、溴甲酚紫（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發中心；95%酒精（分析純）：天津市富宇精細化有限公司；NaCl（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；NaNO2（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸吡哆醛、硫胺素、賴氨酸、酪氨酸、精氨酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的全套試劑和擴增引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。

液體發酵培養基[9-10]：蛋白胨20.0 g、蔗糖5.0 g、（NH4）2SO41.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO41.0 g、羊油 10.0 g（用2%聚乙烯醇乳化，羊油與聚乙烯醇按質量比1 ∶4、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌 20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯浸粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、氯霉素 0.1 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose both，PDB）培養基：馬鈴薯浸粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌 20 min。

H2S 測定培養基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、瓊脂 20.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min；FeCl2溶液：將FeCl2晶體先溶解在較濃鹽酸中，然后再用蒸餾水稀釋，再加入少量鐵粉；在瓊脂凝固前，將等量的FeCl2溶液在無菌條件下注入試管中，待其冷卻凝固即可接種菌株。

生物胺測定培養基[11]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、K2HPO42.0 g、CaCO30.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min；無菌條件下加入硫胺素0.01 g、磷酸吡哆醛0.05 mg、溴甲酚紫0.05 g。

耐鹽測試培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaCl 80.0 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌 20 min。

耐亞硝酸鹽測試培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaNO2150.0 mg、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫培養箱（DPH-420）：天津天泰儀器有限公司；電子天平（FA2004N）：上海青海儀器有限公司；全溫搖瓶柜（HYG-A）：蘇州培英實驗設備有限公司；超聲波細胞粉碎機（BILON88-II）：上海比郎儀器制造有限公司；離心機（TGL20M）：長沙邊佳森儀器設備有限公司；恒溫水浴箱（DK-98-II）：天津泰斯特儀器有限公司；紫外可見光光度計（756S）：上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

無菌條件下，分別將TZH1、TZH3、TZH4 和4QT3這4 株霉菌接種于配制好的PDB 培養基中，30 ℃下培養72 h，制成4 株霉菌的種子菌液。

1.3.2 脂肪酶活力的測定

將菌株的種子菌液接種到液體發酵培養基中，接種量為5%，30 ℃下180 r/min 培養72 h。培養完畢后，取發酵液于4 ℃，8 000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶液，用于測定脂肪酶活力[12]。

取兩個150 mL 的三角瓶，記為為空白組和樣品組。分別向兩組三角瓶中加入4.0 mL 乳化橄欖油底物溶液和5.0 mL 緩沖液，再于空白組中加入95%的酒精15.00 mL，于40 ℃下水浴中預熱5 min，然后各自加入1.0 mL 酶液充分混勻，反應15 min 后立即向樣品組中加入95%的酒精15.00 mL 使反應終止，取出[13]。

向兩組三角瓶中分別滴入兩滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L 的NaOH 標準溶液進行滴定，至微紅色并在30 s 后不褪色為滴定終點，記錄NaOH 標準溶液消耗體積并計算。脂肪酶活力的計算公式如下：

式中：X 為樣品的酶活力，U/g；V1為滴定樣品組時消耗NaOH 標準溶液的體積數，mL；V2為滴定空白組時消耗 NaOH 標準溶液的體積數，mL；c 為 NaOH 標準溶液濃度，mol/L；n1為樣品的稀釋倍數。

1.3.3 生長曲線的測定

分別將菌株以2%的接種量接種于PDB 培養基中，30 ℃下培養，每隔2 h 取菌液測定600 nm 下的OD值，取至36 h，繪制菌株的生長曲線圖。

1.3.4 產H2S 及產生物胺測定試驗

將FeCl2溶液注入到試管中，待瓊脂冷卻凝固后，用移液槍分別吸取4 種菌液各50 μL，插入到瓊脂中進行接種，30 ℃下培育7 d，觀察瓊脂是否變成黑色，若變為黑色則說明該菌株產H2S 記為陽性，不變黑色記為陰性，每株菌做2 個平行試驗[14]。

無菌條件下，稱取1%的賴氨酸、酪氨酸和精氨酸混合氨基酸，添加到生物胺測定培養基中，混勻，對照組培養基中不添加氨基酸。分別將菌株接種到生物胺培養基中，30 ℃下培養3 d，觀察顏色變化，若由黃色變為紫色則說明該菌株產氨基酸脫羧酶記為陽性，反之記為陰性[15]。

1.3.5 抑菌試驗

以大腸桿菌和葡萄球菌作為指示菌。各挑取一環保藏在甘油中的大腸桿菌和葡萄球菌，在平板上劃線活化2 代后，用無菌生理鹽水制成濃度為107cfu/mL的菌懸液。用移液槍分別吸取200 μL 的指示菌菌懸液于PDA 培養基中，用涂布棒涂布均勻，靜置5 min。隨后用6 mm 的無菌打孔器在培養基上打孔。分別取4株菌株的菌液各 50 μL，4 ℃下 8 000 r/min 冷凍離心15 min，加入到培養基孔中，30 ℃下培養48 h。觀察孔周圍是否出現抑菌圈，并記錄出現的抑菌圈直徑，每株菌做2 個平行試驗[14]。

1.3.6 耐鹽性及耐亞硝酸鹽性試驗

將菌株分別接種于含8%NaCl 的耐鹽測試培養基中，對照組不接種菌液，30 ℃下培養72 h，測定600 nm處的OD 值，每組樣品測定3個平行，并計算“對照組OD 值/樣品組 OD 值”的比值[16]。

將菌株分別接種于含0.015%NaNO2的耐亞硝酸鹽培養基中，對照組不接種菌液，30 ℃下培養72 h，測定600 nm 處的OD 值，每組樣品測定3 個平行，并計算“對照組 OD 值/樣品組 OD 值”的比值。

1.3.7 菌株的拮抗試驗與復配試驗

通過上述試驗篩選出2 株合適的菌株，將菌株在PDA 培養基上交叉劃Z 線，30 ℃下培養72 h 后，觀察是否均有菌落生長，劃線的交叉處是否出現相互抑制生長的現象，若無該現象則說明這2 株菌不具有措抗作用[17]。

將 2 株菌的種子液按 1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1 的體積比分別接種于新的PDB 培養基中，30 ℃下培養，在培養12、24、36、48、60、72 h 時取菌液測定 600 nm 處的 OD值，同時測定pH 值。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶活力的測定試驗

在相同條件下對菌株進行培養，脂肪酶活力測定結果如圖1所示。

圖1 菌株產脂肪酶活力Fig.1 Strains producing lipase activity

如圖1所示，THZ1 的酶活力最高為（4.35±0.02）U/mL，其次 TZH4 的酶活力為（3.62±0.05）U/mL，4QT3 的酶活力為（2.63±0.04）U/mL，TZH3 的酶活力為（2.34±0.02）U/mL。菌株TZH1 的酶活力顯著高于其他3 株菌（P＜0.05）。

發酵肉制品在風味形成的過程中，脂類物質起著重要的作用，而脂肪酶能催化脂類物質的反應，有利于風味物質的形成。于華等[18]從四川臘肉中分離獲得一株產脂肪酶能力較強的霉菌，在其最適產酶條件下脂肪酶活力可達384.05 U/100 mL。姚曉蕾[19]采用脂肪酶對豬肉進行酶解，發現其揮發性分為物質有明顯的增加，包括硫化物、有機硫化物、芳香類化合物及含乙醇類物質等。因此菌株的脂肪酶活力越高，越能形成發酵肉制品中的優良風味。

2.2 菌株的生長曲線

4 株菌的生長活性曲線如圖2所示。

圖2 株菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of 4 strains

4 株菌的生長趨勢相似，其中0 h～8 h 為遲緩期，8 h～18 h 為對數期，18 h～26 h 為穩定期，26 h～36 h 為衰亡期。可以看出菌株TZH4 的生長活性較強，其余3株的生長活性相似。

2.3 產H2S和產生物胺測定試驗

4 株菌株進行產H2S 和產生物胺測定試驗結果如表1所示。

表1 菌株產H2S 產生物胺測定結果Table 1 Results of determination of amines produced by strains producing H2S

產 H2S 測定試驗中，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3的瓊脂均無變黑現象，因此這4 株菌均不產生H2S。產H2S 測定試驗中，4QT3 的培養基由黃色變為紫色，其余不變色，因此菌株4QT3 產生物胺，其余3 株菌不產生生物胺。

H2S 是一種有毒物質，不僅影響食品的口味，而且還對人體有害，它被稱為是人體神經的毒劑，是窒息和刺激性較強的危害性氣體[20]。H2S 能與肉品中的還原性血紅蛋白作用生成紫紅色硫化血紅色蛋白，進一步氧化形成綠色[21]。生物胺普遍存在于各種發酵食品，在生物細胞中具有重要的生理功能，但當人體吸收過量的生物胺時，可能會引起頭痛、心悸、血壓變化等過敏性反應[22]。某些微生物則會在充足的生物胺前體物（氨基酸）、具有氨基酸脫羧酶活性以及適合的生長繁殖等條件下產生生物胺[23]。因此篩選用于發酵肉制品的菌株，不得產生H2S 和生物胺。

2.4 抑菌試驗

4 株菌株進行抑菌試驗的結果見表2所示。

表2 菌株的抑菌能力Table 2 Antibacterial ability of the strain

如表2所示，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3 對大腸桿菌的抑菌圈分別為 11.5、18.0、22.5、11.0 mm，TZH1、TZH3、TZH4 和4QT3 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為 11.0、21.5、19.5、14.5 mm。抑菌圈越大，說明抑菌能力越強。

由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 等細菌性食物中毒引起的疾病在我國約占食品安全事件的30%～90%，也是世界范圍內的主要公共衛生問題[24]。致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌通常引起腹部痙攣、水性或血性腹瀉、發燒、惡心和嘔吐等中毒癥狀，常出現在畜禽肉、水產品、奶、蛋等食品中。可以看出，菌株TZH3 和TZH4 的抑菌能力較強，能更好地抑制有害微生物的生長。

2.5 耐鹽性和耐亞硝酸鹽性試驗

4 株菌株進行耐鹽性驗和耐亞硝酸鹽性試驗的結果如圖3所示。

如圖3所示，耐鹽性試驗中，TZH1、TZH3、TZH4和 4QT3 的“對照組 OD 值/樣品組 OD 值”比值分別為1.55、8.57、9.75、2.27。菌株 TZH3 的比值顯著高于其他3 株菌（P＜0.05），比值越大，說明耐鹽性越強。耐亞硝酸鹽性試驗中，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3 的“對照組OD 值/樣品組 OD 值”比值分別為 1.26、2.61、3.58、1.17。菌株TZH3 的比值顯著高于其他 3 株菌（P＜0.05），比值越大，說明耐亞硝酸鹽性越強。

圖3 菌株的耐鹽性及耐亞硝酸鹽性Fig.3 Salt tolerance and nitrite resistance of the strain

一般微生物細胞液的滲透壓為0.85%NaCl 的等滲狀態，微生物在等滲壓的食鹽溶液中代謝活動仍可正常進行，但當增加食鹽時，食鹽溶液的滲透壓大于微生物細胞液的滲透壓，當食鹽的濃度達到13%以上時，可以完全抑制微生物的生長，包括乳酸菌以及大腸桿菌等[25]。當食鹽及亞硝酸鹽達到一定濃度時，會對微生物產生滲透脅迫及毒性作用，使微生物受到抑制甚至死亡[14]。而在發酵肉制品時，難免會用到NaCl 和NaNO2等腌制劑，因此所篩選出的菌株應當具有良好的耐鹽性和耐亞硝酸鹽性。可以看出，4 株菌中TZH3和TZH4 的耐鹽性和耐亞硝酸鹽性較好。

2.6 菌株的拮抗試驗與復配試驗

綜合以上分析，最終選擇TZH3 和TZH4 進行拮抗試驗及復配試驗。將菌株TZH3 和TZH4 在PDA 培養基上交叉劃線培養后，發現均有菌落生長，并且在兩株菌的交叉劃線處均沒有發現相互抑制的現象，說明菌株TZH3 和THZ4 不具有拮抗作用。

菌株THZ3 和 TZH4 復配試驗的 OD 值和 pH 值如圖4和圖5所示。

圖4 復配生長情況比較Fig.4 Comparison of compound growth

由圖4、圖5可以看出當TZH3 和TZH4 的復配體積比為 1 ∶1 時，生長情況較優，且在 48 h 時 OD 值達到最大值。而pH 值變化不大，說明3 種復配比的產酸能力相似。因此可選擇TZH3 和TZH4 的復配體積比為1 ∶1 來對羊肉制品進行發酵。

圖5 復配pH 值比較Fig.5 Comparison of compound pH values

3 結論

本試驗將4 株具有除膻效果的霉菌進行了功能性分析，包括微孢根霉（Rhizopus microsporus）TZH1、米根霉（Rhizopus oryzae）TZH3、米曲霉（Aspergillus oryzae）TZH4、多枝橫梗霉4QT3。通過脂肪酶活力測定試驗、生長曲線的測定、產H2S 和產生物胺測定試驗、抑菌試驗、耐鹽性和耐亞硝酸鹽性試驗、拮抗試驗與復配試驗，驗證菌株安全性。結果表明，菌株TZH3 和TZH4安全性較好，適用于羊肉制品發酵。

近年來，國內許多學者將細菌或霉菌制成混合發酵制劑，接種到羊肉制品中。在發酵過程中，微生物產生的脂肪酶與羊肉中的脂肪酸產生作用，蛋白酶與蛋白質產生作用，對羊肉的風味及質構起到改善作用，一定程度上降低了羊肉的膻味[3]，為發酵制品提供特殊風味和色澤的同時又不會破壞羊肉的品質。現研究多采用直接購買的純種菌株進行肉制品發酵，很少會篩選出具有特定功能性的菌株。菌株TZH3 和TZH4除了能夠產生脂肪酶外，經試驗驗證還具有降解4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的功能，可以制成發酵劑應用于養肉制品發酵，開發新型羊肉制品并改善羊肉風味，對擴大羊肉消費市場具有重要的實現意義。