羊肚菌多糖的提取分離純化及保健功效研究進展

羅倩，鄒榮燦，劉明月，向準

（1.貴州師范學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州省環境工程評估中心六盤水辦事處，貴州 六盤水 553001；3.六盤水市農業委員會，貴州 六盤水 553001；4.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

羊肚菌系子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella）真菌的總稱[1]，又名美味羊肚菌、羊肚子、陽雀菌、蜂窩蘑、羊肚菜、草笠竹等，是世界公認的美味食藥用菌，被譽為“菌中王子”，據《本草綱目》記載，羊肚菌具有化痰理氣、補腦提神、潤胃健脾、補腎強身之功效?，F代研究表明，羊肚菌富含酶、多糖、氨基酸、甾醇、有機酸等活性物質，尤其是羊肚菌多糖越來越成為人們關注的焦點，具有抗腫瘤[2-4]、抗疲勞[5]、抗衰老[6]、抗氧化[7-8]、降血脂[9]、調節免疫[10-11]、抗菌[12]等功效。因此，無論在其藥用還是保健領域，對羊肚菌多糖都具有重要的研究價值和經濟價值。本文基于對羊肚菌多糖的提取分離純化及保健功效的最新研究成果，對羊肚菌多糖的提取、分離純化、理化性質、結構組成及保健功效等方面的研究進展進行綜述，并分析各方法的優勢和弊端，以期為羊肚菌多糖的深入研究及開發利用奠定理論基礎。

1 羊肚菌多糖提取技術

1.1 熱水浸提法

矯麗曼[13]以熱水浸提法提取羊肚菌胞內多糖（Morchella Intracellular Polysaccharide，MIP），并探究其最佳工藝，研究結果表明最佳工藝條件為：料液比1 ∶25（g/mL），提取溫度 90 ℃，浸提時間 2 h，95%乙醇沉淀，在此條件下，多糖得率為7.69%。并進一步對MIP 純品的單糖組分分析表明，MIP 由D-甘露糖和D-半乳糖組成，摩爾比為1 ∶1.06。而鄭燕丹[14]通過液體深層發酵獲得羊肚菌菌絲體胞內多糖的最佳提取工藝條件為：料液比 1 ∶15（g/mL），浸提溫度 90 ℃，浸提時間3 h，50%乙醇沉析。此法雖操作簡單、條件溫和、對儀器設備要求低，但也存在提取率低，提取不完全等缺點。

1.2 超聲波輔助提取法

李美華等[15]采用超聲波輔助提取法提取粗柄羊肚菌菌絲體多糖、菌絲體發酵液濃縮提取胞外多糖。探究二者的最佳提取工藝條件。結果表明：菌絲體多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1 ∶20（g/mL），超聲溫度70 ℃，時間20 min，提取2 次；胞外多糖的最佳提取工藝條件為：濃縮倍數1 ∶5，濃縮溫度50 ℃，醇沉濃度95%，pH 值為6。在此條件下，菌絲體粗多糖平均含量為56.76 mg/g，胞外多糖平均含量為1.28 mg/g。畢博等[16]用相同方法探究尖頂羊肚菌多糖提取工藝為：超聲功率600 W，提取溫度60 ℃，提取時間80 min，70%乙醇沉析，料液比 1 ∶40（g/mL），在此條件下，多糖得率為（2.25±0.04）%。顧旭鋒[17]探究的羊肝菌多糖提取最佳工藝條件為：超聲功率244 W，超聲提取時間24 min，料液比 1 ∶33.90（g/mL），pH 值 8.78，還進一步證實羊肝菌多糖具有顯著的抗疲勞活性。而孟超等[18]對羊肚菌富硒多糖研究發現：料液比1 ∶40（g/mL），提取時間30 min，乙醇濃度90%，是羊肚菌多糖提取的最適方案。超聲波輔助提取羊肚菌多糖具有用時短、得率高、節省能源等優點。但超聲波功率不易過高，否則會對多糖分子結構及特性產生負面影響。

1.3 酶提法

酶提法是利用酶對基體細胞結構的破壞，使細胞內多糖有效的溶出，具有得率高，專一性好，不破壞多糖結構等特點，Sun 等[19]探究酶提法提取富硒羊肚菌菌絲體多糖的最佳工藝條件，研究結果表明：在加酶量為1.5 %，提取時間2 h，酶解溫度40 ℃，料液比為1 ∶15（g/mL）的條件下，多糖提取率可達 11.26%，該工藝簡單、穩定、可行，適用于富硒羊肚菌菌絲體多糖的提取。

1.4 滲透壓法

張嬌等[20]研究滲透壓法提取羊肚菌胞內多糖工藝。以高濃度鹽溶液促進細胞質壁分離，破壁劑破壁處理后，溶脹促進多糖溶出。以硫酸-蒽酮顯色法測定多糖含量，通過單因素和正交試驗優化提取確定滲透壓法最佳提取工藝條件為：浸提時間為120 min，NaCl濃度為20%，浸提溫度90 ℃，pH 值為7.00，在此條件下多糖得率為19.56%。該法具有成本低，得率高，獲得的目標產物便于進一步分離純化等特點。

1.5 高壓脈沖電場法

張玉等[21]利用高壓脈沖電場法對液體深層發酵產羊肚菌菌絲體胞內多糖進行提取和分離。并考察電場強度、脈沖數和料液比等因素對多糖得率的影響，結果表明：多糖最佳提取工藝為：電場強度18 kV/cm，脈沖數 7，料液比 1 ∶27（g/mL），在此條件下多糖得率達56.03 μg/mL。并進一步采用DEAE-52 纖維素離子交換柱和葡聚糖凝膠色譜純化，得到一種分子量高達2.48×106Da 的多糖F1。該法具有在多糖提取過程中，不產生熱量，不破壞多糖結構的優點。

綜上所述，用于羊肚菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酶提法、滲透壓法、高壓脈沖電場法，不同的提取方法提取的多糖得率有一定差異，每個方法均具獨特的特點，因此，建議研究者應根據自己研究的目的、要求、條件及環境選擇適合的方法進行提取。隨著科學技術的不斷進步，一些新的提取技術，如超臨界CO2萃取法，雙水相萃取法等，這些方法尚未用于羊肚菌多糖的提取，能否提高羊肚菌多糖的得率有待進一步研究。

2 羊肚菌多糖的分離純化

經不同提取方法獲得的羊肚菌多糖常含有蛋白、色素、脂類等雜質，需對其進一步純化，脫蛋白的方法有Sevag 法、三氯乙酸法、柱層析法。Sevag 法的優點是條件溫和、成本低、檢測速率快、不會使多糖降解，缺點是多糖易損失。三氯乙酸法脫蛋白較完全、效率高，但易使多糖降解，易殘留還會帶來安全問題；脫色的方法有活性炭脫色法、H2O2氧化法、離子交換樹脂法。H2O2氧化法較常用，該法具有操作簡單、成本低廉、不引入其他雜質的優點，但仍需對H2O2使用濃度嚴格控制，濃度過高不僅會帶來殘留問題，甚至會破壞多糖的分子結構進而影響其生物活性?；钚蕴棵撋膬烖c是吸附能力強，脫色成本低，但在吸附過程中也會損耗多糖。孫玉軍等[22]優化羊肚菌胞外多糖的活性炭脫色工藝。以脫色率和多糖保留率為指標，考察活性炭用量、溫度、pH 值以及脫色時間。結果表明：活性炭脫色的最佳條件為活性炭用量2.00%、溫度50 ℃、pH 值5.00、脫色時間60 min，在此條件下，色素的脫除率為88.90%，多糖的保留率為84.30%，該脫色方法簡便、易行，適合用于羊肚菌胞外多糖的脫色。

要進一步探究羊肚菌多糖的組成、分子質量、結構特征，在脫色脫蛋白的基礎上還需深度分離純化，常用的分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過濾柱色譜法、親和色譜法、膜分離法。Yang 等[23]從羊肚菌子實體中獲得一種新的多糖（MEP-1），經脫蛋白、透析、DEAE-纖維素和Sephadex G-100 凝膠柱柱層析等手段純化后采用化學法、高效液相色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法對多糖的理化性質進行測定，結果表明，多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，平均分子量為43 625 Da。

相對于傳統的分離技術，超濾膜分離技術具有諸優點，如成本低、節能、效率高、環保，在室溫下可連續運行等特點。李蔚等[24]探究超濾技術濃縮純化羊肚菌胞外多糖的最佳條件。以截留率和膜通量為參數，從超濾膜大小、超濾壓力、超濾溫度3 個因素優選最佳超濾條件。結果表明：用截留Mr 10×103的超濾膜，超濾壓力0.10 MPa，超濾溫度20 ℃，在此條件下，胞外多糖截留率達到95.72%。

3 羊肚菌多糖的理化性質及結構組成

分析羊肚菌多糖的理化性質及結構組成是研究其保健功效的重要前提，多糖的理化性質與其相對分子質量具有重要的關系見表1。

表1 羊肚菌多糖的純化手段、相對分子質量及單糖組成Table 1 Purification methods，molecular weights and monosaccharide composition of Morchella polysaccharides

由表1可知，羊肚菌多糖為一種復合雜多糖，不同研究者研究的羊肚菌多糖的單糖組成，比例、種類等有一定差異，可能是原料的來源，提取方法及純化手段不同導致。

4 羊肚菌多糖的保健功效

4.1 抗腫瘤

癌癥已嚴重威脅人類的生命，現代研究表明羊肚菌多糖的具有顯著的抗腫瘤活性，Liu 等[2]采用高壓脈沖電場法獲得羊肚菌多糖，并探究其對人結腸癌TH-29 細胞生長的抑制活性，研究結果表明，羊肚菌多糖具有顯著抑制人結腸癌TH-29 細胞生長的作用，且多糖的量越大抑制效果越明顯。LI 等[3]用羊肚菌與豆渣發酵獲得羊肚菌粗多糖，經DEAE-Sephadex A-50 柱層析和Sephadex G-100 純化后獲得多糖組分MP-1，MP-3 和 MP-4，并對巨噬細胞（RAW267.4）、人肝癌細胞（HepG-2）、人宮頸癌細胞（HeLa 細胞）的活性進行評價，結果表明，MP-3 能增強巨噬細胞RAW264.7 細胞的免疫活性，MP-1 能有效抑制人肝癌細胞（HepG-2）的增長，當濃度為 50 μg/mL 時，抑制率為 68.01%。MP-1，MP-3 和 MP-4 能誘導人肝癌細胞（HepG-2）和宮頸癌細胞（HeLa 細胞）的凋亡。李謠等[4]以黑脈羊肚菌多糖為原料，研究羊肚菌多糖對人乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖和凋亡的影響。結果表明：在無細胞毒性范圍內，羊肚菌多糖能顯著抑制人乳腺癌細胞MDA 的增殖，半數有效濃度0.10 mg/mL，同時人乳腺癌細胞表現出多種細胞凋亡的形態學變化。

4.2 抗疲勞

段巍鶴等[5]以水提法獲得羊肚菌胞外、胞內多糖并對小鼠應急性一次灌胃處理后進行負重游泳實驗，結果表明，胞外多糖組和胞內多糖組小鼠游泳時間與對照組比較均具有顯著性差異（P＜0.05），胞外多糖組為（16.05±0.44）min，胞內多糖組為（14.56±2.86）min，對照組為（6.39±1.43）min，說明胞外多糖、胞內多糖對小鼠應急攝入后具有明顯的抗疲勞作用。

4.3 抗衰老

馬利等[6]以不同濃度尖頂羊肚菌Morchella conica Pers.胞外多糖提取物作用人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF），檢測對細胞形態、細胞增殖、衰老相關β-半乳糖苷酶活性、羥脯氨酸含量的影響，研究結果表明，125 μg/mL 尖頂羊肚菌胞外多糖提取物使HSF 細胞活力增加了25.20%，羥脯氨酸含量增加了12.10%，β-半乳糖苷酶活性降低了48.10%。說明適宜濃度尖頂羊肚菌胞外多糖提取物具有促進HSF細胞增殖、膠原蛋白合成，延緩細胞衰老的作用。

4.4 抗氧化

鮑敏等[7]利用粗柄羊肚菌菌絲體進行液體發酵培養，提取胞外多糖，并對胞外多糖體外抗氧化作用進行初步研究，結果表明：粗柄羊肚菌在1 mg/mL 時對DPPH 自由基和羥自由基以及超氧陰離子的清除率分別達到61.10%，32.80%和71.60%。表明，粗柄羊肚菌胞外多糖具有明顯的抗氧化能力，具有開發為抗氧化類食品或藥品的潛力。Fu 等[8]同樣驗證羊肚菌胞外多糖具有很強的清除自由基能力，能有效抑制血清丙二醛的形成，提高抗氧化酶的活性，且總抗氧化能力與多糖呈量效關系。

4.5 降血脂

明建等[9]對羊肚菌子實體多糖PMEP-1 降血脂作用進行動物試驗，結果發現PMEP-1 顯著降低了高脂大鼠的血清甘油三酯水平、血清低密度脂蛋白膽固醇和動脈粥樣硬化指數，說明PMEP-1 具有降血脂作用，同時對冠心病及動脈粥樣硬化也有一定的預防作用。

4.6 免疫調節

Su 等[10]采用 DEAE 纖維素和 Sephacryl S-300 HR色譜分離從羊肚菌中獲得羊肚菌水溶性多糖（Morchella Water-soluble polysaccharides，MCP），并評價其免疫活性，結果表明，提取的MCP 可調節巨噬細胞內NO的生成，促進脾細胞增殖，經高效液相色譜、紅外光譜和核磁共振譜分析表明，MCP 是均一的甘露聚糖，分子量為81.20 kDa，可作為一種有效的免疫調節劑。Huang 等[11]從尖頂羊肚菌中提取胞內多糖和胞外多糖，也具有很好的免疫活性，50 μg/mL～200 μg/mL 的胞外多糖和 25 μg/mL～200 μg/mL 的胞內多糖顯著抑制巨噬細胞內NO 的產生。

4.7 抗菌

龍正海[12]等對羊肚菌子囊果多糖（Ascocarp polysaccharides）、菌絲體胞內多糖（Mycelium intracellular polysaccharides）、胞外多糖（Extracellular polysaccharides）進行體外抗菌實驗表明，羊肚菌多糖對大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 以及放線菌Actinomycesbovis 的抗菌活性都比較強，而對霉菌Moulds 和酵母菌saccharomyce 的抗菌作用不明顯。結論：3 種羊肚菌多糖均具有比較明顯的抗細菌、抗放線菌活性。

5 展望

羊肚菌為世界性寶貴的食藥用真菌，具有非常高的食用、藥用價值。在食品、藥品和保健品領域具有極大的開發潛力和廣闊的應用前景。現代研究表明，用于羊肚菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酶提法、滲透壓法、高壓脈沖電場法；分離純化方法有離子交換樹脂法、凝膠過濾柱色譜法、親和色譜法，膜分離法。以上方法各具獨特的優勢和弊端，建議研究者根據研究的目的、要求、條件及環境對其合理選擇。試驗表明羊肚菌多糖具有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、抗氧化、降血脂、抗菌、免疫調節等功效。盡管羊肚菌多糖的保健功效已被大量試驗證實，但仍存在一些問題亟須解決：1）羊肚菌多糖藥理活性的作用機制尚未明確，多數保健功效僅以粗提物試驗，對于如何開發符合臨床需求的藥物，還有待進一步深入研究；2）羊肚菌多糖的結構研究還處于一級結構中單糖的組成階段，對于高級結構及構效關系、代謝機理等研究鮮有報道，有待進一步深入研究；3）目前羊肚菌栽培主要以六妹羊肚菌Morchella sextelata 和梯棱羊肚菌Morchellaimportuna 為主，七妹羊肚菌Morchella septimelata 也有少量種植[32]，對于其它品種羊肚菌的規?；N植鮮有報道。到目前為止，羊肚菌的規模種植還存在產量不穩定、可重復性不高等問題。原因是羊肚菌易受氣候條件、生長環境、自然災害等影響，基于羊肚菌多糖的開發利用，攻克羊肚菌的人工規?；耘嗥仍诿冀蓿?）以羊肚菌為原料開發的食品、保健品及藥物制劑有具有保健功能的羊肚菌罐頭[33]、羊肚菌茶[34]、保健酒[35]，具有免疫調節、抗疲勞的羊肚菌多糖顆粒劑[36]，預防或治療更年期障礙的藥劑[37]、但在市場上可見的羊肚菌產品仍然甚少，羊肚菌及羊肚菌多糖的開發利用及產品的工業化還需進一步加快步伐，具有巨大的市場前景。