高效液相色譜-串聯質譜法同時測定酒中6種對羥基苯甲酸酯類防腐劑

趙靈芝，黃笑晨，花中霞，秦江芬，楊莉麗，王可，，

（1．河北師范大學化學與材料科學學院，河北 石家莊 050024；2．石家莊市疾病預防控制中心，河北 石家莊 050011）

作為一類常用的防腐劑，對羥基苯甲酸酯（p arabens，PBs）又稱尼鉑金酯[1]，主要包括對羥基苯甲酸甲酯（methylparaben，MHB）、對羥基苯甲酸乙酯（ethylparaben，EHB）、對羥基苯甲酸丙酯（propylparaben，PHB）、對羥基苯甲酸異丙酯（isoppylparaben，IPHB）、對羥基苯甲酸丁酯（butylparaben，BHB）、對羥基苯甲酸異丁酯（isobutylparaben，IBHB）[2]。與其它類的防腐劑相比較，對羥基苯甲酸酯因具有低毒安全、強殺菌和防腐能力、在較寬的pH 值范圍內有良好的抗菌性能[3]，而被廣泛應用于食品[4-5]、藥品[6-7]、化妝品及個人護理品[8]。盡管如此，研究發現對羥基苯甲酸酯具有一定的雌激素活性和生殖毒性，能夠影響內源性雌激素的代謝，導致線粒體功能障礙[9-10]；且相關研究表明其具有一定的內分泌干擾效應，并與男性不育及乳腺癌的發生存在一定關系[11]。目前，我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規定了十余種食品中對羥基苯甲酸酯的最大使用限量（以對羥基苯甲酸計）不超過0.25 g/kg，經表面處理過的新鮮水果及蔬菜不超過0.012 g/kg。

迄今為止，食品中對羥基苯甲酸酯的檢測方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[12-13]、膠束電動毛細管電泳色譜法（micellar electrokinetic capillary electrophoresis chromatography，MECC）[14]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15]、液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16]等。其中，相比于其它幾種檢測方法，LC-MS/MS法具有靈敏度高、定性定量準確、可實現多種物質痕量測定等優點，在多分析物檢測方面應用廣泛。目前，國內外文獻關于食品中對羥基苯甲酸酯的檢測多為其中的對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯，且檢測對象主要包括了調味品、醬腌菜、即食食品、鮮水果及果蔬汁，而關于酒中6 種對羥基苯甲酸酯的檢測研究還未見報道。因此，本試驗通過對前處理方法、色譜條件和質譜參數的優化，建立了高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 同時測定酒中6 種對羥基苯甲酸酯的檢測方法，旨在為開展酒中防腐劑的檢測及風險評估，加強質量監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

MHB、IPHB、PHB（純度均大于 98.0 %）：德國 Dr.Ehrenstorfer 公司；IBHB（純度 99.0%）：日本東京化學試劑公司；BHB（純度99.0%）：天津科密歐化學有限公司；EHB（純度大于99.0%）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：美國Fisher 公司；甲酸、甲酸銨（色譜純）：美國Dikma 公司；試驗用水為Milli-Q 超純水。所測白酒、紅酒、啤酒、黃酒、果酒和米酒樣品購于石家莊市區超市。

1.1.2 儀器與設備

Agilent 1200-6410B 高效液相色譜三重四級桿串聯質譜儀（配有ESI 離子源）：美國Agilent 科技有限公司；Mettler-Toledo AE240 電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；C3I 型臺式離心機：法國Jouan 公司；MS3 渦旋振蕩器：德國 IKA 公司；N-EVAP-111 氮吹儀：美國Organomation 公司；Milli-Q 超純水機：美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別準確稱取適量 MHB、EHB、PHB、IPHB、BHB和IBHB 6 種標準品，用乙腈溶解配制1 g/L 標準儲備液，保存于-20 ℃冰箱備用。取適量各標準儲備液，用含有25%乙腈的水溶液稀釋，得到1 mg/L 的混合標準液。采用空白基質提取液稀釋，配制 5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L 系列混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品于50.0 mL 離心管中，分別加入1.0 mL 2 mol/L 甲酸銨和10.0 mL 乙酸乙酯，渦旋30 s，超聲提取5 min，然后加入0.5 g 氯化鈉，渦旋混勻，以8 000 r/min 離心5 min。移取乙酸乙酯層，再加入10.0 mL 乙酸乙酯進行二次提取，合并兩次提取液并用乙酸乙酯定容至20.0 mL，取2.0 mL 提取液在 45 ℃下氮氣吹干。用 1.0 mL 乙腈-水（25 ∶75，體積比）溶解，過 0.2 μm 濾膜，待 HPLC-MS/MS 分析。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相：乙腈 -0.1%甲酸（體積分數）水溶液（25 ∶75，體積比）；等度洗脫。

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI），負離子掃描模式；干燥氣：氮氣；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；毛細管電壓：4 000 v；霧化氣壓力：103.4 kPa；掃描方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

對羥基苯甲酸酯的結構中含有酚羥基，容易失去H+，以[M-H]-形式存在。因此，選擇ESI 負離子模式進行檢測。通過全掃描模式得出其母離子[M-H]-，6 種分析物先后通過選擇性離子掃描模式得到相對應的碎裂電壓，然后通過子離子掃描模式獲得定性離子對，同時優化碰撞能。以豐度較大的兩個碎片離子作為各對羥基苯甲酸酯的定性離子，其中相對豐度最大的子離子作為定量離子。6 種對羥基苯甲酸酯的質譜參數見表1。

表1 6 種對羥基苯甲酸酯的質譜參數Table 1 MS/MS parameters of 6 PBs

2.2 色譜條件的優化

本試驗分別以甲醇-水和乙腈-水為流動相，先后嘗試了 XDB-C18，Eclipse plus C18，WCX-1，Poroshell 120 Hilic 及Poroshell 120 EC-C18 5 款色譜柱。結果發現，有機相為乙腈時，6 種化合物的響應信號較高，同時用Poroshell 120 EC-C18 色譜柱分離效果最好，但6種物質仍不能完全分離；向水相中加入0.1%甲酸后，分離效果變好，且以乙腈為有機相，進行等度洗脫，6種目標物可實現完全分離（見圖1）。

圖1 6 種分析物的混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of 6 analytes

2.3 樣品前處理方法的優化

對羥基苯甲酸酯的提取劑多采用乙腈、乙醚，而采用乙酸乙酯的較少。本試驗同時選用乙腈、乙醚和乙酸乙酯為提取劑分別進行加標提取比較。試驗得到6 種分析物在以乙腈為提取劑時的回收率38.0 %～89.8%；以乙醚為提取劑時的回收率為8.5%～55.7%；以乙酸乙酯為提取時的回收率分別為59.3%～116.2%。結果顯示乙酸乙酯的提取效率最好，所以選擇提取效率較好的乙酸乙酯為提取劑。

為了進一步提高6 種化合物的回收率，考慮到對羥基苯甲酸酯的結構中含有酚羥基，易電離，因此嘗試了向試樣中加入酸化劑進行酸化處理。由于鹽酸具有強酸性、甲酸銨呈弱酸性并具有一定的緩沖能力，所以選用了0.03 mol/L 鹽酸和2 mol/L 甲酸銨進行酸化處理，按照“1.3”前處理方法進行試驗。6 種目標物在以鹽酸和甲酸銨為酸化劑時的回收率分別為29.1%～88.1%、75.9%～96.2%，在以甲酸銨為酸化劑進行酸化處理時整體回收率較高，最終選用2 mol/L 甲酸銨進行酸化。

2.4 基質效應

基質效應（matrix effect，ME）是指基質成分和目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使用ESI 模式檢測時，基質主要影響目標化合物的離子化，使其響應信號增強或減弱，從而形成基質增強或抑制效應[17-18]。試驗采用同一質量濃度待測物在基質液與溶劑中峰面積的比值評價基質效應[19]，比值越接近1，則基質效應越小。比值為80%～120%時，表明基質效應較小，可忽略[20]；比值低于80%或高于120%時，表明有較強的基質抑制或增強作用，需用基質匹配標準溶液進行校正。將不含目標物的樣品按“1.3”方法進行提取得到基質溶液，比較了質量濃度為10、50、100 μg/L時酒的基質效應，得到ME 為35.6%～66.8%，表明有較強基質抑制效應，因此采用基質標準曲線進行外標法定量分析。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質提取液配制系列標準溶液，濃度分別為 5、10、20、50 、100、200、500、1 000、2 000 μg/L。以標準溶液質量濃度（X，μg/L）為橫坐標，分析物峰面積（Y）為縱坐標，得到相應的線性方程。以空白樣品為基質，在測定11 個空白樣品的基礎上，分別計算得到每種對羥基苯甲酸酯的檢出限（limit of detection，LOD，S/N=3）與定量限（limits of quantitation，LOQ，S/N=10）[21-22]。6 種對羥基苯甲酸酯的線性關系、檢出限和定量限見表2。

表2 6 種對羥基苯甲酸酯的線性關系、檢出限和定量限Table 2 Linear relationship，LOD and LOQ of 6 PBs

由表2可知，6 種對羥基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 范圍內呈現良好的線性關系，相關系數都可達到 0.999 以上，方法檢出限為 0.8 μg/kg～1.1 μg/kg，定量限為 2.9 μg/kg～3.6 μg/kg。

2.5.2 方法準確度與精密度

取酒空白樣品，分別按 5、100、1 000 μg/kg 3 個水平濃度進行加標回收試驗，每個水平濃度平行測定7次，通過計算得出每種對羥基苯甲酸酯的平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。6 種對羥基苯甲酸酯的平均回收率為76.1 %～108.5 %，RSD 為1.1%～9.1%。表明本方法準確度高，精密度好，能夠滿足酒中6 種對羥基苯甲酸酯的檢測要求，如表3所示。

表3 酒中6 種對羥基苯甲酸酯的加標回收率和相對標準偏差（n=7）Table 3 Spiked recovery and RSD of 6 PBs in wine（n=7）

2.6 實際樣品檢測

利用本方法對購自石家莊市不同超市的30 份酒樣品進行檢測，其中包括白酒、紅酒、黃酒、啤酒、果酒、米酒各5 份。所測樣品中，白酒、啤酒和米酒樣品未檢出對羥基苯甲酸酯，果酒、紅酒、黃酒樣品全部檢出對羥基苯甲酸乙酯，在果酒中含量為5.5 μg/kg ～13.8 μg/kg；紅酒中含量為 6.4 μg/kg ～8.2 μg/kg，黃酒中含量為 5.7 μg/kg ～34.6 μg/kg。此外，在一份黃酒中同時檢出了對羥基苯甲酸異丙酯，含量為1.2 μg/kg。參照GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》關于對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽在調味制品和飲料類制品中的限量標準，所測樣品檢出值均小于國家限量標準。

3 結論

本試驗采用乙酸乙酯為溶劑超聲輔助提取，建立了HPLC-MS/MS 同時測定酒中6 種對羥基苯甲酸酯的方法。試驗結果表明，6 種對羥基苯甲酸酯在5 μg/L～2 000 μg/L 的質量濃度范圍內線性關系良好，檢出限為 0.8 μg/kg～1.0 μg/kg、定量限為 3.1 μg/kg～3.6 μg/kg，該方法前處理操作簡便、靈敏度高、精密度好、準確度高，適用于酒中6 種對羥基苯甲酸酯的定性定量分析。