盤縣火腿微生物多樣性及主體揮發性風味解析

母雨，蘇偉，母應春

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

盤縣火腿作為貴州省特色產品，于2012年取得國家地理標志產品”稱號，具有獨特的地域特色[1]。風味是干腌火腿最重要的質量指標之一，其形成途徑主要有兩條：一是火腿中的脂肪、蛋白質等物質在內源酶的作用下產生風味物質；二是微生物的生長繁殖產生大量風味代謝產物[2]。近年來，對于干腌火腿揮發性風味的研究較多，如劉登勇[3]通過氣味指紋技術確定了金華、宣威和如皋火腿的主體風味；譚椰子等[4]研究了金華、宣威和如皋火腿3 個不同年份皮下脂肪的揮發性風味成分，得到15 種可區分不同樣品的主體風味物質。但是，對于火腿揮發性風味物質與微生物組成的相關性研究較少，Wang 等[5]認為火腿揮發性風味的形成與自然環境（如微生物）和原料肉有關；黃盼盼等[6]綜述了微生物與火腿風味的關系，認為火腿中的優勢微生物是其風味形成的關鍵；Martínez-Onandi 等[7]報道微生物來源的揮發性化合物占伊比利亞火腿總揮發性化合物的6%以上。因此，微生物與香氣物質的關聯分析對于火腿品質的提升有著重要意義。

為了解干腌火腿中的微生物組成，過去常依賴培養法，但某些環境因素會使部分微生物隨機地進入可存活但不可培養（viable but non-culture，VBNC）狀態，導致無法培養和檢測[8]。近年來興起的Illumina MiSeq高通量測序技術具有準確率高、操作簡單、成本低等優勢，已被廣泛應用于食品微生物組成的研究[9]。在食品風味研究領域，固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法占有重要地位。SPME 技術集合了采樣、萃取、濃縮和進樣，大大提升了檢測速率；GC-MS 則常用于風味化合物的分離和鑒定。

本研究利用Illumina MiSeq 高通量測序技術和SPME-GC-MS 對不同地區盤縣火腿的微生物組成和分布進行調查，并測定其揮發性風味化合物的種類和含量，旨在明確盤縣火腿的優勢微生物和主體風味化合物，并挖掘潛在功能微生物。

1 材料與方法

1.1 主要設備與試劑

1.1.1 主要設備

NanoDroB1000 超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6c 電泳儀：北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp9700 PCR儀：美國ABI 公司；Bio-Tek ELx800 酶標儀：美國Bio-Tek 公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina 公司；M220 基因剪切儀：中國基因有限公司；QuantiFluorTM-ST 微型熒光計：美國Promega 公司；7980GC-700MS 氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫公司；75 μm CAR/PDMS 萃取頭：上海洽姆儀器科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

土壤DNA 快速提取試劑盒：美國MP Bio 公司；2%瓊脂糖凝膠：西班牙Biowest 公司；FastPfu 聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒：美國Axygen 公司；TruSeqTMDNA Sample Prep Kit：美國 Illumina 公司。

1.2 樣品采集

火腿樣品采自貴州省盤州市不同地區：烏蒙鎮（WM）、普古鎮（PG）和紅果新區（HG）。所有樣品采集兩份裝入無菌密封袋中，24 h 內干冰運送至實驗室并儲存于-80 ℃冰箱中，一份用于DNA 提取，另一份用于風味檢測。

1.3 高通量測序試驗方法

1.3.1 總DNA 提取與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

在無菌條件下取10 g 肉樣充分混勻，用MP-soil DNA 試劑盒提取樣品總DNA。然后用超微量分光光度計對DNA 濃度和純度進行檢測，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。純化后的DNA 用于細菌16S rRNA 和真菌 ITS 基因的擴增。以 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3’） 和 806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物對細菌V3-V4 可變區進行PCR 擴增；以 ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3’） 和 ITS2R （5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）為引物對真菌 ITS1 區進行PCR 擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，27（細菌）/35（真菌）個循環，72 ℃延伸 10 min。擴增體系（20 μL）：4 uL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5mmol/L dNTPs，0.8 uL 引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA 模板，剩下的用ddH2O 補齊。

1.3.2 Illumina Miseq 測序

使用2%瓊脂糖凝膠回PCR 產物，然后利用DNA凝膠回收試劑盒對產物進行純化，Tris-HCl 緩沖液洗脫后用2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR 產物用QuantiFluorTM-ST 微型熒光計藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。根據Illumina MiSeq 平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300 的文庫。

構建文庫步驟：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR 擴增進行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA 片段。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.4 揮發性風味成分檢測方法

1.4.1 頂空固相微萃取

首先將萃取頭置于250 ℃老化2 h，再準確稱取5.00 g 樣品置于20 mL 頂空瓶中并插入老化后的萃取頭，在40 ℃下萃取30 min，之后將萃取頭拔出并插入氣質聯用儀進樣口，在250 ℃條件下解吸5 min 后進行檢測分析。

1.4.2 GC-MS 檢測條件

色譜條件：DB-WAX 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；恒定流量模式；柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持 15 min，然后以 3 ℃/min 升到 160 ℃，保持 0 min，再以 4 ℃/min 升到 230 ℃，保持 5 min。載氣：He；流量：0.8 mL/min。

質譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描范圍25 ms～400 ms。

1.4.3 定性及定量方法

定性方法：試驗數據與數據庫NIST 和WILEY 中的圖譜進行對比分析，再結合保留指數進一步確定。選用C6～C18的正構烷烴為標準，計算各揮發性化合物的保留指數（retention index，RI），并與數據庫進行對比，計算公式如下：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n+1）分別為待測揮發性成分、含n 個碳原子正構烷烴及n+1 個碳原子正構烷烴的保留時間，min。

定量分析：以25 mg/L 的環己醇為內標，采用內標法計算樣品中各組分的含量，計算公式如下：

式中：CX和MX分別為待測揮發性化合物的濃度（mg/L） 和峰面積；C內標和 M內標分別為內標物的濃度（mg/L）和峰面積。

1.4.4 主體揮發性風味評價方法

采用氣味活動值（odor activity value，OAV）法對火腿的主體風味成分進行評價，各揮發性風味化合物的OAV 值按下式計算：

式中：Ci為某揮發性風味化合物的含量，μg/g；Ti為該化合物的嗅覺閾值，μg/kg。

1.5 數據分析

利用Trimmomatic 軟件去除長度低于50 bp、平均質量值低于20 的序列；使用FLASH 軟件進行拼接，barcode 需精確匹配，引物允許2 個堿基的錯配，去除模糊堿基，根據重疊堿基overlap 將兩端序列進行拼接，overlap 需大于10 bp，去除無法拼接的序列。使用UPARSE 軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類；然后使用核糖體數據庫項目（ribosomal database，RDP）分類器針對Silva（SSU123）數據庫使用70%的置信度閾值分析每個序列的分類；最后使用UCHIME 軟件鑒定并除去嵌合序列。Mothur 軟件用于評估α 多樣性；聚類分析圖是根據QIIME 軟件計算結果使用R 軟件繪制的。對于網絡圖的繪制，首先利用SPSS 計算微生物與核心風味物質間的皮爾遜相關系數，然后利用Cytoscape 軟件進行網絡可視化。

2 結果與分析

2.1 測序結果

火腿樣品測序數據統計分析見表1。

如表1所示，剔除不合格序列后，從三地樣品中共獲得227 253 個有效真菌序列和140 276 個有效細菌序列，基于97%相似度發現真菌和細菌OTU 數量分別為139 和808。雖然真菌序列數大于細菌，但細菌OTUs 數量遠高于真菌，表明細菌多樣性高于真菌。所有樣品的真菌和細菌覆蓋率均為0.99，表明測序深度已足夠反映樣品所包含的微生物群落。

表1 火腿樣品測序數據統計分析Table 1 Statistical analysis of ham sample sequencing data

2.2 微生物多樣性分析

三地樣品的Alpha 多樣性指數如表2所示。

表2 火腿樣品的α 多樣性Table 2 The α diversity index of ham samples

群落豐富度與Chao1 和ACE 指數的大小呈正相關；而群落多樣性與香農指數呈正相關，與辛普森指數呈負相關。三地樣品的細菌豐富度和多樣性均大于真菌，樣品間的豐富度和多樣性高低順序為：HG>WM>PG。

2.3 微生物群落組成分析

群落組成分析可反映不同樣品在各分類學水平上的組成情況。火腿樣品細菌類群門和屬水平分布圖見圖1。

圖1 火腿樣品細菌類群門和屬水平分布圖Fig.1 Phylum and genus-level distribution of bacteria in ham samples from Panxian

圖1A 和圖1B 分別顯示樣品在細菌門（phylum）水平和屬（genus）水平的群落組成情況，圖1B 只顯示了豐度前十的屬，其余屬被歸為“other”。從盤縣三地樣品中共檢測到24 個細菌門，其中以Firmicutes（厚壁菌門）為優勢菌群，約占OTU 總數的44.5%，其次為Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria（放線菌門），約占OTU 總數的36.48%和14.72%。在屬水平，從三地樣品中共鑒定出433 個細菌屬，WM 火腿中獲得245 個屬，其中優勢類群包括Nocardiopsis（擬諾卡氏菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Virgibacillus（枝芽孢桿菌屬）、Halomonas（鹽單胞菌屬）及Idiomarina，分別占樣品總豐度的16.78%、16.31%、10.17%、9.20%和5.76%；在PG 火腿中獲得191 個屬，以葡萄球菌屬（45.39 %）、鹽單胞菌屬（12.58 %）、Brevibacterium（短桿菌屬，5.76 %）及 Chromohalobacter（5.51 %）優勢菌屬；在HG 火腿中獲得372 個屬，優勢菌屬有葡萄球菌屬（32.45%）、鹽單胞菌屬（8.56%）、Alkalibacillus（6.76%）、Chromohalobacter（5.39%）和Idiomarina（5.24%）。

火腿樣品真菌類群門和屬水平分布圖見圖2。

圖2 火腿樣品真菌類群門和屬水平分布圖Fig.2 Phylum and genus-level distribution of fungi in ham samples from Panxian

圖2A 和圖2B 分別展示樣品在真菌門（phylum）水平和屬（genus）水平（豐度前十）的群落組成情況，圖2B 只顯示了豐度前十的屬，其余屬被歸為“other”。三地樣品共檢出2 個細菌門，以子囊菌門（Ascomycota）為優勢菌群，約占真菌OTU 總數的98.7%。在屬水平，共鑒定出68 個真菌屬，WM 火腿中獲得52 個屬，其中優勢菌群為Aspergillus（曲霉菌屬）和Penicillium（青霉菌屬），分別占樣品總豐度的74.08%和15.41%；在PG 火腿中獲得32 個屬，以曲霉菌屬（93.39%）為優勢菌屬；在HG 火腿中獲得55 個屬，優勢菌屬包括曲霉菌屬（83.75 %）、青霉菌屬（6.50 %）和 Yamadazyma（5.23%）。

結果表明盤縣火腿的微生物組成豐富，不同地區盤縣火腿的優勢微生物群落存在一定差異，但葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬和曲霉菌屬在三地樣品中均占優勢。其中，葡萄球菌屬在我國金華和宣威火腿中同樣作為最優勢菌[10]，具有較高的蛋白酶和脂肪酶活性，有助于發酵肉制品特殊風味的形成[11]。鹽單胞菌屬作為一種中度嗜鹽菌，具有高淀粉酶活性[12]，常分離于鹽湖、鹽堿地及海洋等，也存在于發酵食品中[13]。而曲霉菌屬是我國金華火腿和意大利圣丹尼火腿的優勢真菌[14-15]，具有隔絕空氣、抑制有害菌生長等多種功能[16]。

2.4 OTU水平的樣品聚類分析

為研究不同火腿樣品物種組成結構的相似性和差異性，根據每個樣品的OTU 組成情況進行聚類分析，使用非加權平均算法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）構建樹狀結構，可視化不同樣品的差異程度?；诩毦驼婢鶲TU 的聚類樹圖見圖3。

圖3 基于細菌和真菌OTU 的聚類樹圖Fig.3 Cluster tree based on bacteria and fungi OTU

圖3A 是基于細菌OTU 豐度的聚類，圖3B 是基于真菌OTU 豐度的聚類。結果表明HG 和PG 火腿的細菌OTU 水平相近，而HG 和WM 火腿的真菌群落相似性更高。

2.5 GC-MS定量結果

火腿樣品的揮發性風味化合物含量見表3。

表3 火腿樣品的揮發性風味化合物含量Table 3 Contents of volatile flavor compounds in ham samples from Panxian

續表3 火腿樣品的揮發性風味化合物含量Continue table 3 Contents of volatile flavor compounds in ham samples from Panxian

如表3所示，三地樣品共檢出51 種揮發性風味化合物，其中 WM 33 種，PG 和 HG 各 41 種。檢出的風味物質可分為七大類：醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、烴類及其它類。通過表3中各類物質的分類總結可知，PG火腿中醛類、醇類、酮類及酯類物質含量最高，特別是3-甲基丁醛、己醛、1-已醇、2-戊酮、2-庚酮和己酸乙酯。在WM 火腿中，酸類和其他類物質含量及種類最高，主要包括3-甲基丁酸、庚基己基醚及甲苯。烴類物質在HG 火腿中的含量最高，但烴類物質閾值較高，對火腿風味貢獻甚微。

為進一步篩選各火腿樣品的主體風味組成，根據表3中各物質的含量結合嗅聞閾值確定OAV 值。OAV法能從眾多揮發性風味物質中篩選出對整體風味有重要貢獻的物質，通常認為OAV≥1 的組分對樣品風味有重要貢獻，且OAV 值越大，對風味影響越大[20]。三地火腿揮發性化合物氣味活度值OVA 分析見表4。

表4 三地火腿揮發性化合物氣味活度值OVA 分析Table 4 OAVs of volatile compounds in Panxian ham from three regions

如表4所示，三地樣品共檢出OAV≥1 的關鍵風味化合物10 種，包括5 種醛類，1 種醇類，2 種酮類及2 種酯類。醛類化合物大部分來源于不飽和脂肪酸的氧化，少部分由美拉德反應生成，此類物質閾值較低，一般具有水果味，是火腿風味成分中最重要的一類化合物[21]。己醛在三地樣品中均是含量最大的醛類物質，來自于脂肪酸的氧化降解，在低濃度時呈青草香氣，高濃度時呈酸臭味[22]。支鏈醛2-甲基丁醛和3-甲基丁醛主要來自氨基酸的Strecker 降解，具有干果味、奶酪味和咸味，是意大利干腌火腿中含量最大的風味成分[23]。3-甲基丁醛在3 地樣品中的OAV 值最大，表明它對盤縣火腿的風味品質有重要影響。另外，壬醛有助于增加甜味和果味香氣，而辛醛具有油脂味和辛辣味[24]。

醇類化合物的形成與脂肪氧化和酮類物質的還原反應密不可分。三地樣品中含量較高的醇有乙醇、1-己醇和1-辛烯-3-醇，但OAV≥1 的僅有1-辛烯-3-醇。這是因為醇類物質具有相對較高的閾值，對風味貢獻一般較小，但某些不飽和醇具有較低的閾值，如花生四烯酸氧化形成的1-辛烯-3-醇具有蘑菇味，是干腌火腿風味的重要組成部分[3]。

酮類化合物主要來自脂質的氧化降解和氨基酸或蛋白質之間的相互作用，其同樣具有較低的閾值并主要表現為花香味，對干腌火腿香味有重要影響的酮類物質主要是甲基酮[25]。三地樣品中檢出含量較大的甲基酮為2-庚酮和2-壬酮。這兩種酮類物質在Istrian干腌火腿中大量存在，具有強烈的奶酪香氣，有助于火腿風味的形成[26]。

酯類化合物主要來自于羧酸和醇的酯化反應，由短鏈酸形成的酯具有果味，而由長鏈酸形成的酯具有脂肪氣味[27]。在三地樣品中檢出的酯類物質有己酸乙酯和辛酸乙酯。這兩種酯類物質具有甜味和果香味，通常作為發酵果酒中的特征風味化合物，對酒體香氣有重要貢獻[19，28]。

2.6 微生物與揮發性風味物質的關聯分析

為了探索盤縣火腿微生物群落中的潛在功能微生物，通過計算微生物與風味物質的皮爾遜相關系數，構建主要微生物屬（豐度≥1%）與特征風味物質（OAV≥1）的相關性網絡圖。盤縣火腿微生物群落與風味物質相關性分析見圖4。

圖4 盤縣火腿微生物群落與風味物質相關性分析Fig.4 Correlations Analysis between microbial community and flavor compounds in Panxian ham

如圖4所示，綠色節點代表微生物，黃色節點代表風味，節點間連線的粗細表示兩者皮爾遜相關系數的大小，連線顏色為紅色表示正相關，藍色表示負相關。結果顯示，鹽單胞菌屬、Nesterenkonia（涅斯捷連科氏菌屬）和短桿菌屬與3-甲基丁醛、2-庚酮、己醛、辛醛及己酸乙酯呈正相關；Idiomarina、Burkholderia -Paraburkholderia、Ralstonia（雷氏菌屬）、Acinetobacter（不動桿菌屬）及未分類的Oxalobacteraceae（草酸桿菌科）與相連的所有風味物質呈負相關；豐度較大的葡萄球菌屬和曲霉菌屬與2-甲基丁醛、2-壬酮及1-辛烯-3-醇呈正相關，與壬醛呈負相關。因此，葡萄球菌屬、曲霉菌屬、鹽單胞菌屬、涅斯捷連科氏菌屬及短桿菌屬可能是盤縣火腿的潛在風味貢獻者。

3 結論

研究對不同地區盤縣火腿進行微生物多樣性分析及揮發性風味物質檢測。從三地樣品中共檢出24 個細菌門和2 個真菌門，以厚壁菌門和子囊菌門為優勢菌門。在屬水平上，共檢出438 個細菌屬和68 個真菌屬，在WM、PG 和HG 火腿中均占優勢的菌群為葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬和曲霉菌屬。在OTU 水平上，PG和HG 火腿的細菌菌群結構類似，而WM 和PG 火腿在真菌群落結構上更相。從盤縣火腿中檢測到51 種揮發性風味物質，根據OAV≥1 的原則從WM、PG 和HG 火腿中分別篩選出8 種、10 種及9 種關鍵風味物質。基于微生物與風味物質的皮爾遜系數構建相關性網絡圖，對盤縣火腿中潛在功能微生物進行挖掘，結果表明葡萄球菌屬、曲霉菌屬、鹽單胞菌屬、涅斯捷連科氏菌屬和短桿菌屬可能是盤縣火腿的潛在風味貢獻者。