黔苦5號全麥蕎茶的營養與抗氧化、免疫調節功效評價研究

曾海英，毛佳怡，李勇，朱怡，石明，秦禮康，2，6

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省蕎麥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省薏苡工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；4.貴州省植保植檢站，貴州 貴陽 550001；5.黔西南喀斯特區域發展研究院，貴州 興義 562400；6.西南藥食兩用資源開發利用技術國家地方聯合工程研究中心，貴州 貴陽 550025）

蕎麥屬蓼科（Polygonaceae），蕎麥屬（Fagoprum），是雙子葉植物。蕎麥屬有兩個栽培種，即苦蕎和甜蕎[1]。苦蕎所含蛋白質、脂肪、維生素、微量元素等都普遍高于其他作物[2-3]。苦蕎兼具食用和藥用價值，在我國醫書《齊民要術》、《備急千金要方》、《群芳譜·谷譜》等著作中均有關于苦蕎治病、防病之說。現代研究表明：苦蕎黃酮具有降血糖血脂、抗疲勞、抗缺血、抗氧化、增強機體免疫力等多種保健作用[4-6]。

貴州地處西南，獨特的地理優勢孕育著豐富的苦蕎資源，尤其是2016年國務院1 號文件把特色小雜糧作為糧食結構改革和特色作物產業發展重點后，貴州作為苦蕎種植的三大基地之一，迎來了新的機遇，蕎麥產業已成為貴州精準扶貧產業和大健康的特色優勢產業。據統計，截止2016年，貴州蕎麥種植面積近80 萬畝，年產量約10 萬噸，主要集中分布在畢節和六盤水等區域。黔苦5 號苦蕎是貴州省威寧縣農科所選育，2010年通過全國小宗糧豆品種鑒定委員會鑒定（鑒定編號為國品種鑒雜2010010）的貴州特有苦蕎品種[7]，近年來在全省范圍內被廣泛種植。然就其加工適應性、營養品質、功能組分活性及延伸產業鏈、開發精深加工產品缺乏科學、系統的理論與數據支撐。因此，本課題以黔苦5 號蕎麥為原料，生產貴州特色全麥蕎茶為研究對象，對其營養品質、抗氧化活性及免疫調節作用進行綜合性評價，以期為黔苦5 號苦蕎品種開發應用提供基礎數據支撐，助力貴州苦蕎產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔苦5 號全麥蕎茶（QB5T）以貴州黔苦5 號蕎麥為原料生產的貴州特色苦蕎茶產品，由貴州蕎麥生產企業提供，對照組（CK）為貴州黔苦1 號全麥蕎茶。

KM 小鼠：6 周～8 周齡，雌雄各半，SPF 級，體重（20±2）g，重慶騰鑫生物技術有限公司提供，實驗動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；IgG、IgM 測定試劑盒：上海鼓臣生物技術有限公司；雞紅細胞、補體（豚鼠血清）：貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室自制。

蘆丁、山奈酚、槲皮素、沒食子酸標品：上海源葉生物科技有限公司；VC：湖南南化化學試劑廠；DPPH、ABTS：Sigma 公司；環磷酰胺：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；2，4-二硝基氟苯 （2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：成都西亞試劑有限公司；瑞氏染料：天津市光復精細化工研究所。以上均為分析純。

1.2 儀器

TU-1810 紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FW100 高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M 臺式高速冷凍離心機：長沙邁佳森儀器設備有限公司；SpectraMax 190 光吸收酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；MoticAE31 倒置相差顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；MB90 水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司；JA1003 分析天平：上海精科儀表有限公司；1220 型液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 感觀評價

擬定詳細的感官評分標準及分值，評定組由食品專業人員10 人組成，男女比例為1 ∶1，感觀評分標準表如下。

表1 苦蕎茶感官評價指標Table 1 Sensory evaluation index of tartary buckwheat tea

1.3.2 營養成分分析

蛋白質的測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；脂肪的測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；碳水化合物的測定：采用“減差法”[8]；水分的測定：MB90 水分測定儀測定；灰分的測定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

1.3.3 功效成分分析

1.3.3.1 多酚測定

沒食子酸標準曲線繪制：精密稱取沒食子酸標品10 mg，于10 mL 容量瓶中用60%乙醇溶解定容至刻度，搖勻。分別配制沒食子酸濃度為 0、4、8、16、24、32、40、48、56 μg/mL 的標準溶液。精準吸取每個濃度的待測液0.2 mL，分別加入3 mL 飽和碳酸鈉溶液和1 mL福林酚顯色劑，混勻，26 ℃避光反應1 h。于765 nm 波長處測定其吸光度。以吸光度和沒食子酸質量濃度求得回歸方程，繪制標準曲線。

多酚的測定：準確稱取樣品2 g，加入一定乙醇溶液，水浴回流加熱提取，冷卻后于3 000 r/min 離心15 min，抽濾。用60%乙醇將澄清液定容至50 mL 即得到多酚待測液。取樣液0.2 mL，與標準曲線相同的方法測定樣品中多酚總含量。

1.3.3.2 黃酮測定

參照李勇等[9]的方法。蘆丁、槲皮素、山奈酚等標準曲線制作略。

黃酮的測定：精稱粉碎干樣品1 g，60%乙醇20 mL，50 ℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加60%乙醇5 mL 清洗3 次，離心合并上清液，于 50 mL 容量瓶中定容，搖勻，過 0.22 μm 微孔濾膜，即得到黃酮待測液。取待測液0.2 mL，與標準曲線相同的方法測定樣品中黃酮含量。

色譜條件：Agilent C1（8150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 ∶0.4 %磷酸溶液（體積比1 ∶1）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量：20 μL。

1.3.4 抗氧化能力測定

參照李海珊等[10]方法稍作修改，準確稱取經粉碎樣品 1 g，用 60 %的乙醇溶液，料液比 1 ∶25（g/mL），50 ℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加60%乙醇溶液5 mL 清洗然后離心合并上清液重復3 次，于50 mL 容量瓶中定容備用。分別將苦蕎茶醇提物和VC配成濃度分別為0、25、50、100 μg/mL 的待測液。

1.3.4.1 清除DPPH 自由基能力測定

用甲醇稀釋DPPH 至517 nm 下吸光值為0.98±0.02 得DPPH 自由基工作液，置于陰暗處反應40 min，4 ℃保存。取不同組別樣液100 μL 分別與DPPH 自由基工作液 3.9 mL 混合，反應 30 min。用 100 μL 甲醇和3.9 mLDPPH 自由基工作液反應作對照，用無水乙醇為空白調節分光光度計，于517 nm 處測定吸光度。

計算公式：清除率/%=（A對照-A樣品）/A對照×100

式中：A樣品為樣品液 100 μL 與 DPPH 自由基工作液 3.9 mL 混合吸光度，A對照為甲醇 100 μL 和 DPPH自由基工作液3.9 mL 混合吸光度。

1.3.4.2 清除ABTS+自由基能力測定

取 7 mmol/L ABTS 5.00 mL 和 140 mmol/L 過硫酸鉀88 μL，避光反應16 h，將ABTS 溶液用乙醇稀釋至在734 nm 波長處吸光值為0.7±0.02，取ABTS+自由基工作液3.9 mL 與樣品液100 μL 混合，避光反應15 min。用100 μL 乙醇和3.9 mL ABTS+自由基工作液反應作對照，用無水乙醇為空白調節分光光度計，于734 nm處測定吸光度。

計算公式：清除率/%=（A對照-A樣品）/A對照×100

式中：A樣品為樣品液 100 μL 與 ABTS＋自由基工作液 3.9 mL 混合吸光度，A對照為乙醇 100 μL 和 ABTS＋自由基工作液3.9 mL 混合吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP 法）測定

用0.25 mol/L、pH 3.6 的乙酸緩沖液溶解TPTZ（10 mmol/L）和FeCl（320 mmol/L）配成FRAP 工作液。取樣品液 0.5 mL 與FRAP 工作液 3.5 mL 混合，在 37 ℃下孵育10 min，用無水乙醇作空白對照，于593 nm 處測其吸光值。以FeSO4作為標準曲線。

1.3.5 免疫調節能力測定

1.3.5.1 構建小鼠免疫低下模型

參照宋金星等[11]方法稍作修改，KM 小鼠，隨機分為空白對照組、環磷酰胺對照組、苦蕎茶組高劑量組（TBH）、苦蕎茶組中劑量組（TBM）、苦蕎茶組低劑量組（TBL），高、中、低組灌胃劑量分別為600、300、150 mg/kg bw，每組10 只。各組小鼠腹腔注射環磷酰胺溶液，注射量為60 mg/kg bw，空白對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續3 d，構建環磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。小鼠免疫功能低下模型建立后，實驗各組按照各自劑量灌胃，空白對照組及環磷酰胺對照組灌胃等劑量的生理鹽水。

1.3.5.2 脾臟和胸腺指數測定

連續灌胃9 d 后禁食不禁水；24 h 后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，稱重記數，計算脾臟指數及胸腺指數。脾臟指數＝脾臟質量（mg）/體重（g），胸腺指數＝胸腺質量（mg）/體重（g）。

1.3.5.3 耳腫脹率測定

連續灌胃6 d 后，于腹部涂抹8%的硫化鈉去毛，均勻涂抹5%DNFB 50 μL；3 d 后于小鼠左耳均勻涂抹 1%DNFB 20 μL，于右耳均勻涂抹 20 μL 丙酮溶液進行對照；24 h 后頸椎脫臼處死，用打孔器取直徑8 mm 的耳片，稱重，計算腫脹率，腫脹率/%=[左耳質量（mg）/右耳質量（mg）-1]×100。

1.3.5.4 血清中IgG、IgM 含量測定

連續灌胃10 d 后摘眼球取血，1 500 r/min 離心10 min 取血清，按照IgG、IgM 測定試劑盒的使用說明書進行測定。

1.3.5.5 血清溶血素水平測定

連續灌胃6 d 后，腹腔注射2%雞紅細胞混懸液0.2 mL；4 d 后摘眼球取血，1 500 r/min 離心 10 min，取血清，用生理鹽水稀釋至100 倍；取1 mL 加10%的雞紅細胞懸浮液0.5 mL、10%的補體1 mL，混合均勻于37 ℃水浴30 min，置0 ℃冰箱中終止反應。1 500 r/min離心5 min，取上清液于540 nm 處測吸光度值。與不加血清的生理鹽水試管作對照。

1.3.5.6 單核-巨噬細胞吞噬能力測定

連續灌胃6 d 后，每只小鼠腹腔注射4%的淀粉肉湯1 mL，以引誘體內的巨噬細胞向腹腔聚集；間隔2 h 后，每只小白鼠注射1%的雞紅細胞懸液1 mL。再間隔2 h，頸椎脫臼處死，放置于27 ℃環境下避免尸體僵硬，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2 mL，用手輕柔5 min，吸取腹液1 mL 均勻涂于載玻片上，立即37 ℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進行觀察。計數：油鏡下觀察，以巨噬細胞數200 個為記數范圍，同時記數其中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數，記錄結果，計算吞噬率，吞噬率/%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞/200×100。

2 結果與分析

2.1 感觀、營養及功效成分分析

黔苦1 號全麥蕎茶、黔苦5 號全麥蕎茶感官、營養及功效成分測定結果見表2。

表2 QB5T 及QB1T 感官、營養及功效活性組分測定結果Table 2 Determination results of sensory，nutrient and bioactivity components of QB5T and QB1T

從表2感官評分及沖飲特性上分析，QB5T 與QB1T 差異顯著（P＜0.05），QB5T 茶湯更明亮，色金黃，有濃烈的麥香，夾帶焦香，無異味。常規營養指標上，兩者無顯著差異，但QB5T 蛋白質含量達20.12%，較趙鑫[12]研究的11 個全麥苦蕎茶蛋白高，可作為植物蛋白的良好來源[13-14]。QB5T 碳水化合物含量為69.50%，但苦蕎比小麥含有更多的抗性淀粉和膳食纖維，因此苦蕎引起糖尿病人血糖指數增加比小麥等谷物均低[15]。故此，蕎茶在能滿足糖尿病人對糖喜好及能量需求下，又能保持血糖穩定性，是糖尿病人的理想飲品之一。

QB5T 與QB1T 的黃酮組分高效液相色譜圖見圖1。

圖1 QB5T 與QB1T 的黃酮組分高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of QB5T and QB1T

與QB1T 相比，QB5T 總黃酮及多酚含量豐富，分別為20.21 mg/g 和27.70 mg/g，顯著高于 QB1T（P＜0.05）。全麥蕎茶黃酮組分主要為蘆丁、山奈酚及槲皮素，由圖1可知，QB5T 所含黃酮組分，其中蘆丁為主成分，占黃酮含量的90.20%，含量為18.23 mg/g；山奈酚和槲皮素分別為 660.00 μg/g 和 412.33 μg/g。

2.2 醇提物的抗氧化活性

QB1T、QB5T 抗氧化活性評價結果見表3。

QB5T 醇提物的還原力及 ABTS＋·、DPPH·清除率結果見圖2。

表3 QB5T 及QB1T 的抗氧化活性評價Table 3 Evaluation of antioxidant activity of QB5T and QB1T ethanol extract

由表3可知，QB5T 醇提物在 ABTS＋·、DPPH·自由基清除率和鐵還原力方面均顯著強于QB1T（P＜0.05），可能與其黃酮、多酚等物質含量較高有關。QB5T 與VC相比，兩者抗氧化活性均隨著質量濃度的增加而增加，且呈現量效關系。QB5T 對ABTS·+和DPPH·的IC50分別為 90.76 μg/mL 和 79.61 μg/mL，僅次于 VC的 71 μg/mL和 65.24 μg/mL；當 QB5T 質量濃度為 100 μg/mL 時，其最大清除率分別達59.53%、75.02%，自由基清除活性良好，這與B?aszczak W 等[16]的研究結果一致。相同濃度水平下QB5T 醇提物的FRAP 值相對高于 VC，且FRAP 值隨著質量濃度的增加而增大，當質量濃度達到100 μg/mL 時，QB5T 醇提物的 FRAP 值達 255.24 μg FeSO·47H2O eq/mL，VC為 231.72 μg FeSO·47H2O eq/mL，表明QB5T 醇提物具有較好的還原能力且強于VC。

圖2 QB5T 醇提物的還原力及ABTS+·、DPPH·清除率Fig.2 Reducing power and free radical scavenging rate of ABTS+·and DPPH·of QB5T ethanol extract

2.3 苦蕎茶醇提物的免疫調節活性

QB5T 醇提物的免疫調節活性見圖3。

由圖3可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組差異極顯著P＜0.01）。QB5T 醇提物各劑量組，灌胃免疫低下小鼠，小鼠各項免疫指標均顯著或極顯著高于模型對照組，且呈現劑量-效應關系。QB5T醇提物高劑量組（TBH）免疫調節活性最強，表現在胸腺指數增加顯著（P＜0.05），脾臟指數增加極顯著（P＜0.01），分別為4.98 mg/g 和7.77 mg/g，表明QB5T 醇提物能修復小鼠脾臟和胸腺或促進其發育[17]；IgG、IgM 含量增加極顯著（P＜0.01），分別為 1092.71、168.75 mg/100 mL，較模型組分別提高2.36 倍和1.91 倍，表明QB5T 醇提物可提高血清中IgG、IgM 含量水平，提升體液免疫能力[18]；血清溶血素水平提高極顯著（P＜0.01），OD450值為0.49，表明QB5T 醇提物可提高血清溶血素水平，進而提高機體體液免疫能力[19]；耳腫脹率增加極顯著（P＜0.01），耳腫脹率為122.09%，較模型組提高64.69%，表明QB5T 醇提物可提高細胞免疫功能；吞噬率增加極顯著（P＜0.01），吞噬率為 49.20 %，表明 QB5T 醇提物可提高機體非特異性免疫功能[20]。

圖3 QB5T 醇提物的免疫調節活性Fig.3 Immunoregulation activity of QB5T ethanol extract

3 結論

貴州苦蕎資源豐富，作為主要產區之一，衍生出眾多苦蕎企業與苦蕎產品。黔苦5 號蕎麥生產的全麥蕎茶是地方優育品種生產的具有代表性的一類蕎茶產品，其品質優良，營養豐富，多酚（27.70 mg/g）、總黃酮含量（19.83 mg/g）等功能活性組分含量高，醇提物具有較好的ABTS+·、DPPH·清除能力和還原能力，且濃度為100 μg/mL 時自由清除率分別為59.53%、75.02%，其自由清除率僅次于VC，而FRAP 值為255.24 μg FeSO4·7H2O eq/mL，高于VC，表現出較好的抗氧化活性。黔苦5 號全麥蕎茶醇提物各劑量組均可提高免疫低下小鼠的胸腺和脾臟指數、血清中IgG、IgM 含量、血清血溶素水平、耳腫脹率及單核-巨噬細胞吞噬率，且高劑量組效果極顯著（P＜0.05），呈現劑量-效應關系，表現出較好的免疫調節作用。