超聲波-微波協同輔助提取堿蓬多糖及抗氧化性分析

李煦，徐美，吳玉文，周自成，范小振

（滄州師范學院化學與化工學院，河北 滄州 061001）

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）又名黃須菜、海英菜，是一種抗鹽能力出眾、生命頑強的鹽堿地指示植物，能有效減少鹽堿地區土壤表層含鹽量[1]，提高土壤動植物有機質含量，改善土壤環境，是近年來改良、開發鹽堿土壤的首選植物，能夠取得較好的生態、經濟效益[2]。鹽地堿蓬富含營養，其種籽油含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸；莖葉中含有大量維生素和多種微量元素。近年來，對鹽地堿蓬的研究，主要集中在其種籽油的提取[3]、總黃酮的提取測定[4]及其中無機元素的確定[5]。多糖是由多個單糖通過脫水形成的糖苷鏈，具有降血糖[6]、抗腫瘤[7]、調節機體免疫[8]、抗氧化[9]、抗衰老等功效。目前對鹽地堿蓬中多糖提取工藝的研究相對較少，且效率較低。因此，迫切需要開發出一條時間短、效率高、工藝簡單的堿蓬多糖提取工藝，為進一步開發鹽地堿蓬的經濟價值，保持和重建鹽堿地生態，提高鹽堿土壤農產品附加值提供智力支持。

提取植物多糖的方法有水提法、堿提法、酶提法、微波輔助法、超聲波輔助法、超聲-微波協同法等。劉玉芬等[10]采用水提法提取堿蓬多糖，最佳提取條件為：提取溫度 87 ℃、提取時間 3.5 h、液料比 31.5 ∶1（mL/g），在此條件下堿蓬粗多糖得率為2.028%。該方法雖成本低廉、操作簡單，但得率較低。龐庭才等[11]采用堿提法提取堿蓬多糖，最佳提取條件為：NaOH 溶液濃度0.17 mol/L，料液比 1 ∶42.5（g/mL）、提取溫度 83.5 ℃、提取時間3.4 h，此條件下多糖提取率較水提法大大增加，為8.00%。馬波等[12]對酶法輔助超聲波提取鹽地堿蓬多糖進行了研究，在堿性果膠酶加入量為0.4 %，pH 10，料液比 1 ∶25（g/mL），超聲溫度 45 ℃，時間20 min，超聲功率120 W 的條件下，堿蓬多糖提取率可達8.56%。使用超聲波輔助提取可縮短提取時間，降低提取溫度[13-14]。但超聲波輔助提取熱效應不強，在提取過程中難以達到足夠高的提取溫度[15]，超聲-微波協同法將微波與超聲波的優點結合，使植物細胞內部多糖從細胞中釋放出來的效率更高，速度更快[16-17]。

目前，超聲-微波協同輔助提取鹽地堿蓬多糖的報道尚未見到。文中采用超聲-微波協同法輔助提取鹽地堿蓬莖葉多糖，并通過響應面分析法優化堿蓬多糖的提取工藝，以期為鹽地堿蓬資源的進一步開發利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽地堿蓬莖葉粉末：采集于河北省滄州市沿海地區，40 ℃干燥至恒重后，用粉碎機粉碎20 s，過60 目篩，密封備用。

硫酸亞鐵、無水乙醇、雙氧水（30%）、葡萄糖、苯酚：均為分析純試劑，天津市永大化學試劑有限公司；抗壞血酸（VC）、叔丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、 三 羥 基 氨 基 甲 烷（trihydroxy aminomethane，Tris）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：均為分析純，國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XO-SM200 型超聲波微波組合反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；UV-2550 型紫外分光光度計：日本島津公司；TDL-5 型低速臺式大容量離心機：江蘇省金壇醫療儀器廠；FA2004N 型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；SL-100 型高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠；101A-1E 型電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；HHS-11-1 型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鹽地堿蓬莖葉中多糖的提取與測定

按照一定料液比，準確稱取一定質量的鹽地堿蓬莖葉粉末，添加80 mL 蒸餾水，混合均勻后，設定超聲-微波協同提取條件進行多糖的提取，離心，上清液為多糖溶液。

鹽地堿蓬莖葉中多糖的測定采用苯酚-硫酸法[18-19]，得率的計算按照如下公式：

式中：K 為鹽地堿蓬莖葉多糖得率，%；n 為稀釋倍數；C 為測得多糖溶液質量濃度，g/mL；V 為提取液體積，mL；M 為鹽地堿蓬樣品質量，g。

以葡萄糖溶液質量濃度為X 軸，以吸光度為Y軸，繪制出繪制標準曲線，可得多糖回歸方程為：Y=7.235 7X-0.008 3，R2=0.996 6。

1.3.2 單因素試驗

依據上述提取方法，以蒸餾水為提取劑，選擇超聲功率、料液比、提取溫度、提取時間4 個因素作為變量對鹽地堿蓬莖葉中多糖提取工藝進行研究。在試驗過程中，固定微波功率200 W，各因素的考查范圍分別為：超聲功率 120、240、360、480、600 W；料液比 0.3 ∶80、0.5 ∶80、0.7 ∶80、1.0 ∶80、2.0 ∶80、3.0 ∶80（g/mL）；提取溫度 40、50、60、70、80 ℃；提取時間 5、10、15、20、25 min。

1.3.3 響應面試驗設計

在微波功率200 W 條件下，根據響應面分析法中Box-benhnken 的中心組合試驗設計原理，以料液比、超聲功率、提取時間、提取溫度4 個因素為自變量，設計四因素三水平共29 個試驗點的響應面分析試驗，響應面因素水平表如表1所示。

表1 響應曲面設計試驗因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response suiface design

1.3.4 抗氧化性分析

1.3.4.1 清除羥基自由基活性測定

將6.3 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和6.7 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各2.00 mL 均勻混合，添加不同質量濃度（0.38、0.95、1.90、2.85、3.80、5.10 mg/mL）的鹽地堿蓬多糖溶液2.00 mL，啟動反應時添加8.8 mmol/L 雙氧水，靜置10 min，取上層清液于510 nm 處測定吸光度，計算清除率。配置同等濃度梯度的VC溶液，在相同條件下測定吸光度，進行對照[20]。

清除率計算公式如下：

式中：Ai為樣品吸光度；Ai0為以蒸餾水代替雙氧水的吸光度；A0為以蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

1.3.4.2 清除超氧陰離子自由基活性測定

取 4.5 mLTris-HCl 緩沖溶液（pH 8.2），25 ℃預熱10 min，加入0.1 mL 不同質量濃度的堿蓬多糖溶液，均勻混合后于25 ℃水浴靜置10 min，加入鄰苯三酚于25 ℃水浴反應10 min，加入HCl 終止反應，測定325 nm處吸光值。用蒸餾水代替堿蓬多糖溶液，采用同樣方法進行對照試驗，計算樣品對超氧陰離子自由基的清除率[21]。清除率計算公式如下：

1.3.4.3 清除DPPH活性測定

取不同質量濃度的堿蓬多糖溶液各1.0 mL，加入DPPH 溶液，避光反應30 min 后，于517 nm 處測定吸光值，計算樣品對DPPH·的清除率[22]。清除率計算公式如下：

式中：Ai為DPPH·與樣品混合溶液的吸光值；Ai0為樣品與無水乙醇混合液的吸光值；A0為DPPH·與蒸餾水混合溶液的吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對鹽地堿蓬多糖得率的影響

以蒸餾水為提取劑，在微波功率200 W，提取溫度70 ℃、超聲功率360 W、提取時間15 min 的條件下，考察不同料液比對鹽地堿蓬多糖得率的影響，結果如圖1所示。

圖1 料液比對得率的影響Fig.1 Effect of soild-liquid ratio on the extraction rate

由圖1可見，隨料液比增大，多糖得率呈現先升高后下降趨勢。在0.5 ∶80（g/mL）時得率最高，為9.7%。料液比增加，多糖的溶出量隨之增加，得率升高；當料液比繼續增大，多糖溶出可能達到飽和，但加入的物料質量在增加，導致得率降低[23]。所以料液比選擇0.5 ∶80（g/mL）。

2.1.2 提取時間對鹽地堿蓬多糖得率的影響

2.3 引產期間胎盤娩出情況 本組48例引產者中有44例胎兒及胎盤附屬物完全自行娩出，另有2例胎盤及其附屬物娩出不徹底，行B超引導下清宮術輔助終止妊娠，2例藥流聯合水囊引產失敗后行鉗刮術，完全流產率為91.7 % (44/48)。引產成功病例中產后清宮率4.3%(2/46)。

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取溫度70 ℃、超聲功率360 W 的條件下，考察不同提取時間對鹽地堿蓬多糖得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 提取時間對得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate

由圖2可見，隨提取時間延長得率呈先升高后下降趨勢，在20 min 時達到最高，為9.8%。可能在提取時間較短時，多糖釋放不充分；提取時間延長后，細胞破碎程度加大，溶出量提高，得率也提高；當超過20 min后，得率降低，可能是鹽地堿蓬多糖在較長時間的超聲波作用下結構和性質發生了變化，如降解為單糖[24-25]，導致多糖得率的降低。因此提取時間選擇20 min。

2.1.3 提取溫度對鹽地堿蓬多糖得率的影響

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、超聲功率360 W、提取時間20 min 的條件下，考察不同提取溫度對鹽地堿蓬多糖得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate

由圖3可見，隨著提取溫度的升高，得率呈先上升后下降的趨勢；在70 ℃時得率達到最高。升高溫度有助于溶劑的滲透和多糖的擴散；超過70 ℃后，水分蒸發量增加明顯，可能對多糖的溶出造成不良影響，溫度過高也可能使多糖結構發生改變，導致已溶出多糖的降解，從而使堿蓬多糖得率降低[26-27]。所以提取溫度選擇70 ℃。

2.1.4 超聲功率對鹽地堿蓬多糖得率的影響

在微波功率 200 W、料液比 0.5 ∶80（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間20 min 條件下，考察不同超聲功率對鹽地堿蓬多糖得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 超聲功率對得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由圖4可見，隨超聲功率增大得率呈先升高后下降趨勢；在360 W 時達到最高，為9.8%。原因可能是超聲功率較小時作用力不強，細胞破碎程度不足，多糖溶出較少；較高功率的超聲波會降低空化作用，使氣泡塌縮程度不足[28]，導致多糖得率下降。因此，超聲功率選擇360 W。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果

在微波功率200 W 條件下，根據響應面分析法中Box-benhnken 的中心組合試驗設計原理，以提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、超聲功率（D）為自變量，設計四因素三水平共29 個試驗點的響應面分析試驗。結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 RSM design and results

2.2.2 回歸模型方差擬合及結果分析

利用Design Expert 8.0.6 統計軟件對響應面試驗數據進行回歸分析，得到結果如表3所示。經二次多元回歸擬合，得到回歸方程如下：

提取率/%=-62.238 75+1.221 00A+38.041 67B+1.058 17C+0.074 632D+0.050 000AB-4.500 00×10-3AC-4.166 67×10-5AD+0.050 000BC+1.041 67×10-3BD+3.261 28×10-18CD-0.052 290 0A2-42.125 00B2-7.100 00×10-3C2-1.039 93×10-4D2

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

模型的 F 值為 105.63，P＜0.000 1，差異極顯著。通過對試驗模型可信度進行分析，得到R2=0.990 6，R2adj=0.981 2，接近于1，表明響應值的變化有99.06%來自于所選因素，該方程擬合度較好。失擬項P 值為0.4585，差異不顯著，說明該響應面模型所設計并進行的非正常試驗誤差較小，二次模型具有合理性[29]，可以用此模型來確定提取鹽地堿蓬多糖的最佳工藝條件。通過因素顯著性來分析模型系數，可以看出因素AC 即提取時間和提取溫度的交互作用極顯著，其他單因素之間交互作用顯著性不明顯。F 值的大小反應了各因素對于多糖得率的影響強弱，各單因素對多糖得率的影響順序是：料液比＞提取時間＞超聲功率＞提取溫度。

2.2.3 響應曲面分析

各因素對鹽地堿蓬莖葉多糖得率的影響及各因素之間的交互作用如圖5所示。

由響應面曲線形狀可以判斷出各因素對鹽地堿蓬莖葉中多糖得率的影響程度。響應曲面越陡峭，表明該因素對多糖得率影響越顯著[30]。圖5a 為提取時間、料液比的交互作用，料液比的響應曲面更加陡峭，因此料液比對多糖得率的影響較提取時間更為顯著；圖5b 為料液比、超聲功率的交互作用，料液比的響應曲面更加陡峭，因此料液比對多糖得率的影響較超聲功率更為顯著；圖5c 為提取時間、提取溫度的交互作用，提取時間的響應曲面更加陡峭，因此提取時間對多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5d 為料液比、提取溫度的交互作用，料液比的響應曲面更加陡峭，因此料液比對多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5e 為提取溫度、超聲功率的交互作用，超聲功率的響應曲面更加陡峭，因此超聲功率對多糖得率的影響較提取溫度更為顯著；圖5f 為提取時間、超聲功率的交互作用，提取時間的響應曲面更加陡峭，因此提取時間對多糖得率的影響較超聲功率更為顯著。該結論與表3方差分析相符合。響應曲面等高線圖中，等高線的形狀為橢圓形表示因素存在顯著交互作用，圓形表示不顯著[31]。圖5中各組等高線均為橢圓形，說明各因素對多糖得率存在交互作用。

圖5 兩因素交互作用對得率的影響Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the oil extraction rate

2.2.4 響應面設計最佳工藝條件及驗證性試驗

對回歸方程求解，得到響應面擬合的鹽地堿蓬莖葉中多糖提取工藝的最佳條件為：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率365.61 W、提取時間20.69 min、提取溫度69.75℃。預測優化后的得率為10.6374%。結合儀器的現實要求，將最佳工藝參數修正為：料液比 0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率366 W、提取時間21 min、提取溫度70 ℃。取3 等份鹽地堿蓬莖葉原料進行平行驗證試驗，試驗結果分別為：10.739%、10.681%、10.722%，驗證試驗所得平均得率10.714%，與理論預測值相比，其相對誤差為0.720。結果表明，經過相應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合，證明響應面法可以有效的優化鹽地堿蓬莖葉多糖提取工藝。

2.3 抗氧化性試驗結果

2.3.1 堿蓬多糖清除羥基自由基的活性測定

圖6為不同質量濃度的堿蓬多糖和VC清除羥基自由基的活性對比。VC對羥基自由基的清除率接近100%，堿蓬多糖在濃度較低時清除羥基自由基的活性很差，隨濃度增大其對羥基自由基清除率迅速升高，在濃度達到2.85 mg/mL 后，羥基自由基清除率隨堿蓬多糖質量濃度增加變化不再明顯。堿蓬多糖濃度達5.1 mg/mL 時羥基自由基清除率最高，達到89.2%。

圖6 羥基自由基清除試驗Fig.6 Experimental results on the elimination of hydroxyl radicals

2.3.2 堿蓬多糖清除DPPH·的活性測定

不同質量濃度的堿蓬多糖對DPPH·的清除活性如圖7所示，選擇VC進行對照試驗。隨濃度增大堿蓬多糖對DPPH·的清除率逐漸增加，當濃度達到5.1 mg/mL時對DPPH·清除率最高，達到81.9%。

圖7 DPPH·清除試驗Fig.7 Experimental results on the elimination of DPPH·

2.3.3 堿蓬多糖清除O2-·的活性測定

不同質量濃度的堿蓬多糖和VC對O2-·的清除活性如圖8所示，兩者對O2-·的清除活性均隨質量濃度的增大而增大，當濃度達到5.1 mg/mL 時兩者對O2-·的清除活性均為最高，堿蓬多糖達到79.2%。雖然活性較VC低，但能夠說明鹽地堿蓬多糖在濃度較高時對超氧陰離子自由基的清除效果良好。

圖8 超氧陰離子清除試驗Fig.8 Experimental results on the elimination of O2-·

3 結論

以鹽地堿蓬莖葉粉末（60 目）為原料，選擇超聲-微波協同法提取鹽地堿蓬莖葉中多糖。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對提取工藝進行優化，得出結論如下：

響應面試驗的最佳提取工藝為：料液比0.51 ∶80（g/mL）、超聲功率 366 W、提取時間 21 min、提取溫度70 ℃。在此優化條件下多糖得率為（10.714±0.720）%，接近響應面優化法得到的理論值。

抗氧化性能試驗表明，鹽地堿蓬莖葉多糖對于羥基自由基、DPPH·和O2-·均有較強的清除能力，其抗氧化活性隨多糖濃度增加而增大，濃度達到5.1 mg/mL時，對羥基自由基、DPPH·和O2-·的清除率分別為89.2%、81.9%、79.2%，接近VC。說明鹽地堿蓬莖葉多糖具有較強的抗氧化性能，可以作為天然抗氧化劑應用于食品、醫藥等行業，具有一定的開發前景和應用價值。