紫薯酒釀造工藝優化及揮發性香味成分分析

袁杰彬，孫 琳，李 茂

（宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓644000）

紫薯是一種富含花青素的薯類新品種，除含有普通甘薯所具有的營養物質以外，還富含紫薯花青素（PSPAs），已有研究證實紫薯花青素具有消炎[1]、抗氧化生物活性[2]、抗突變[3]、對肝損傷提供保護[4]、抗動脈粥樣硬化[5]等益處。以紫薯為原料，參照果酒釀造工藝開發的紫薯酒飲料新品，具有良好的色澤和薯香，有別于傳統的調配酒飲料，不僅保留了絕大部分紫薯營養物質，還保留了紫薯中的花青素。發酵是紫薯酒生產過程中的重要環節，直接影響后期成品酒的品質，本研究采用Box-Behnken響應面法對紫薯酒發酵條件進行優化，找出最佳發酵條件，同時對紫薯酒的香氣成分進行研究，采用頂空固相微萃取法提取富集紫薯酒的香氣成分物質，再運用GC-MS聯用法對紫薯酒中香氣組分進行測定和分析，盡可能詳細表達出紫薯酒的香味特征。為進一步提高紫薯酒品質做好基礎研究，促進紫薯產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料

紫薯：產地四川宜賓。

試劑及耗材：檸檬酸、碳酸鈣，國產分析純；α-淀粉酶、糖化酶，無錫賽德生物工程有限公司；安琪高活性釀酒干酵母；矢車菊素標品，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；高速冷凍離心機，德國eppendorf；安捷倫7890氣相色譜儀質譜儀聯用；紫外可見分光光度計，國產754型；酒精計、糖度計，成都科普達科技有限公司；恒溫培養箱，上海一恒科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫薯汁制備

紫薯蒸煮熟透，去皮切塊后按照料液比為1∶2加水（含0.01%檸檬酸）打漿，經α-淀粉酶液化，糖化酶糖化后過濾取汁，冷藏備用。

1.2.2 發酵條件

1.2.2.1 單因素實驗設計

溫度對紫薯酒發酵影響：調整發酵液起始糖度為20 °Bx，pH4.0，接菌量為3.0‰，分別于16 ℃、20℃、24℃、26℃、28℃、32℃發酵7 d，測定酒精度及花青素含量。

pH值對紫薯酒發酵影響：初始糖度調整為20°Bx，分別調發酵液pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.5，接菌量均為3.0‰，于26℃發酵7 d，測定酒精度及花青素含量。

初始糖度對紫薯酒發酵影響：發酵液pH4.0，分別調整糖度為16 °Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26°Bx，接菌量均為1.5‰，于26℃發酵7 d，測定酒精度及花青素含量。

接菌量對紫薯酒發酵影響：發酵液初始糖度均調整為20°Bx，pH4.0，調整接菌量依次為0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰，26℃發酵7 d，測定酒精度及花青素含量。

1.2.2.2 響應面實驗設計

根據單因素實驗結果，采用4因素3水平的Box-Behnken響應面設計方法進行試驗，見表1，以酒精含量和花青素含量為響應值，優化發酵條件。

表1 響應面實驗因素水平編碼表

1.2.3 紫薯酒香氣成分測定

取8 mL紫薯酒于20 mL萃取瓶中，加入1.0 g氯化鈉，48℃吸附平衡30 min。吸附結束后將吸附有目標物質的萃取頭插入進樣口，解析6 min。用相同方法處理其余待測酒樣。

色譜分析條件：選擇不分流模式，程序升溫：35℃保持5 min，以10℃/min升至100℃，保持3 min，以15℃/min升至230℃，保持5 min。載氣為高純度氦氣，流量為1 mL/min，進樣口溫度和檢測器及各接口溫度均設定為250℃。

質譜分析條件：電力方式為EI,電壓70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍30～800 u。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 酒精度

參照GB/T 15038—2006測定。

1.2.4.2 花青素含量[7]

將紫薯酒于12000 r/min離心5 min，取上清液，以水為空白，將稀釋后的酒液于530 nm處測定吸光度，3次測定值求平均值。原酒中花青素含量的（μg/mL）計算公式：

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 溫度對紫薯酒發酵影響

溫度對紫薯酒發酵的影響如圖1所示，隨著發酵溫度的逐步升高，紫薯酒中花青素含量在一定溫度范圍內較為穩定，超過24℃，花青素含量呈下降趨勢；酒精含量隨著溫度的升高而逐漸增加，當溫度達到22℃時酒精含量最高，進一步升高溫度，加快了酵母生長老化速度，酒精度及花青素含量均降低。綜合考慮兩種評價指標選擇發酵溫度，確定20℃、22℃、24℃為紫薯酒的響應面優化設計對應溫度因素水平，以確定最佳發酵溫度。

圖1 溫度對紫薯酒發酵的影響

2.1.2 pH值對紫薯酒發酵影響

pH值對紫薯酒發酵的影響見圖2。由圖2可知，隨著發酵起始pH值逐步提高，花青素含量逐漸降低，酒精度在pH3.5～4.5區間有一明顯頂點值，最大酒精含量為12.8%vol，之后酒精度逐漸下降。綜合考慮兩種評價指標選取發酵液初始pH最佳值，確定初始pH3.5、pH4、pH4.5為紫薯酒的響應面優化設計對應因素水平，以確定最佳初始pH值。

圖2 pH值對紫薯酒發酵的影響

2.1.3 初始糖度對紫薯酒發酵影響

初始糖度對紫薯酒發酵的影響結果如圖3所示，隨著糖度的逐步提高，酒精度也隨之呈上升趨勢；糖度在16～22°Bx之間，花青素含量趨于穩定，含量變化不明顯，但當糖度大于22°Bx后，花青素含量明顯降低。綜合考慮兩種指標，選取初始糖度20 °Bx、21 °Bx、22 °Bx作為紫薯酒發酵條件響應面分析對應因素水平，以確定最佳發酵條件。

圖3 初始糖度對紫薯酒發酵的影響

2.1.4 接種量對紫薯酒發酵影響

酵母接種量對紫薯酒發酵的影響如圖4，實驗結果表明，接種量介于0.25‰～1‰之間時存在頂點值，當接種量為0.5‰時，酒精度與花青素含量均達到最大，之后逐步下降，隨著接種量逐步增大，花青素含量基本趨于穩定，但酒精度下降趨勢較為明顯。綜合考慮兩種指標，選取接種量0.3‰、0.5‰、0.7‰作為紫薯酒發酵條件響應面分析對應因素水平，以確定最佳發酵條件。

圖4 接種量對紫薯酒發酵的影響

2.2 響應面法優化發酵條件

2.2.1 響應面設計及結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件中BBD方法進行實驗設計，共需安排27組試驗，并分別以各組原酒的酒精度和花青素含量作為雙響應值。結果如表2。

2.2.2 回歸模型的建立及分析

2.2.2.1 模型建立

根據表3中實驗結果進行多元回歸方程擬合，并分別以酒精度（R1）和花青素含量（R2）為響應結果建立數學回歸模型：

表2 響應面優化試驗設計及結果

2.2.2.2 回歸分析

由表3可知，模型的P=0.0006＜0.01，說明所構建的模型方程（Ⅰ）為極顯著；模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，由模型Ⅰ失擬項p=0.5909＞0.05為極不顯著；模型決定系數R2=0.8971，校正決定系數R2（Adj）=0.8771，說明該模型與實際擬合度較高，響應值的87.7%是由于所選變量引起；模型的離散系數CV值反映了實驗的精度水平，該值越小，精度越高。當花青素含量為響應時實驗結果C.V=2.67%，表明試驗操作可信度較好。證明所構建回歸方程模型能很好地預測和分析對應的紫薯酒原酒酒精度。

模型回歸方程系數顯著性分析結果見表4，可知模型方程（Ⅰ）中除一次項B、D和二次交互項AD、BC為不顯著外，其余各項均對酒精度的影響達顯著水平。其中二次交互項BD，各二次項均為極顯著，一次項A、C，交互項AB、AC、CD均為顯著水平。通過比較各一次項系數絕對值，可知各因素對紫薯酒酒精度含量影響的強弱關系：初始糖度＞溫度＞初始pH值＞接種量。

由表4可知，模型的P=0.0003＜0.01，說明所構建的模型方程（Ⅱ）為極顯著；模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，由模型失擬項p=0.8435＞0.05可知不顯著；模型決定系數R2=0.9082，校正決定系數R2（Adj）=0.851，說明模型與實際擬合度較高，響應值的85.1%是由于所選變量引起；模型的離散系數CV值反映了實驗的精度水平，該值越小，精度越高。當花青素含量為響應時實驗結果C.V=7.79%，在可接受范圍內，試驗操作可信度較好。證明所構建回歸方程模型能很好地預測和分析對應的紫薯原酒中花青素含量。

表3 方差分析結果(R值為酒精度)

表4 方差分析結果(R值為花青素含量)

對模型回歸方程系數顯著性分析結果見表4，可知模型方程（Ⅱ）中除一次項B和二次交互項AB、BC、BD、CD為不顯著外，其余各項均對花青素含量的影響達顯著水平。其中一次項A、C，交互項AC及二次項A、B、C、D均為極顯著；一次項D、交互項AD均為顯著水平。通過比較各一次項系數的絕對值，可知各因素對紫薯酒中花青素含量影響的強弱關系：溫度＞初始糖度＞接種量＞初始pH值，其中溫度對花青素的穩定性、初始糖度、接種量均影響顯著，考慮到花青素在酸性環境中較穩定[11]，在本實驗中pH值范圍均為酸性，因此實驗中pH值變化對花青素穩定性影響表現出不顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過對表3、表4方差分析結果，對各因素間的交互作用對紫薯酒發酵的影響顯著的交互項進行響應面及等高線圖分析。結果見圖5—圖10。

圖5 初始pH值與溫度對酒精度的影響

圖6 初始糖度與溫度對酒精度的影響

圖7 接種量與初始糖度對酒精度的影響

圖8 接種量與初始pH值對酒精度的影響

圖9 接種量與溫度對花青素含量的影響

圖10 初始糖度與溫度對花青素含量的影響

2.2.4 驗證實驗

通過軟件對實驗數據進行優化，得到最佳紫薯酒發酵工藝參數為：溫度21.47℃，初始pH3.89，初始糖度20.63°Bx，酵母接種量0.55‰，所得紫薯酒原液中所含花青素含量為19.86 μg/mL，酒精度為13.46%vol。為對響應面優化法所得的實驗條件數據進行可行性檢驗。根據實際條件進行發酵試驗，選取試驗參數為溫度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接種量0.55‰。選取3次平行實驗，最終得到紫薯酒原酒花青素含量為19.52 μg/mL，酒精度為13.2%vol。與預測值對應誤差分別為1.71%、1.93%。驗證了所建模型能較準確地預測實驗結果，再次證明基于響應面優化紫薯酒發酵模型的可靠性。

2.3 紫薯酒香氣成分分析[12-17]

如圖11所示，通過GC-MS對紫薯酒中所含揮發性香氣檢測，利用NIST圖譜庫進行檢索，紫薯酒中共檢測到約40種揮發性香氣成分（表5），約占95%檢測圖譜中總峰面積，根據結構性質不同可以分為醇類、醛類、醚類、酚類、酯類、酮類及烷烴類物質。其中醇類包括丙醇、丁醇、異戊醇、異丁醇、正己醇、順-3-己烯醇、3-甲氧基苯甲醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜烯醇、萜品醇、苯乙醇；酯類包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、亞油酸乙酯、十八碳-6,9-二烯酸乙酯；酚類物質包括4-甲基愈創木酚、2,6-二叔丁基對甲酚、對乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚；酮類物質包括3-羥基-2-丁酮、2-吡咯烷酮、吡喃-4-酮、α-吡喃酮、紫羅蘭酮；醚類物質有乙基叔丁基醚、仲丁基醚、乙基丁基醚。其中含量較高的物質有乙酸乙酯、異戊醇、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯、萜品醇、苯乙醇。

圖11 紫薯酒香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖

3 結論

本實驗利用響應面法優化紫薯酒的發酵工藝參數，經驗證優化后的工藝參數為：溫度21.5℃，初始pH4.0，初始糖度21°Bx，酵母接種量0.55‰。此條件下所得紫薯發酵原酒酒精度數和花青素含量分別為13.2%vol和199.52 μg/mL。紫薯酒的香氣是由許多呈香呈味物質組分間共同作用構成，香氣成分作為紫薯酒重要品質指標，其揮發性物質種類與含量直接體現出酒體的品質特征，為后期進一步提升紫薯酒品質提供重要參考。

表5 紫薯酒主要香味物質