高溫大曲中霉菌的篩選及其揮發性產物分析

魯 珍，王紅照，李恩中，胡 莉，張建設，郜勝勤

（1.黃淮學院生物工程系，河南駐馬店463000；2.河南豫坡酒業有限責任公司，河南駐馬店，463900）

醬香型白酒是我國的傳統香型，醬香突出，幽雅細膩，歷史悠久。醬香型白酒中的醬香風味物質主要來源于高溫大曲，高溫大曲制曲過程中醬香風味物質的形成與微生物發酵及其所代謝的酶系、美拉德反應有著密切的聯系[1]。細菌、酵母是主要的生香微生物，但霉菌也能產生一些風味物質或風味前體物質，對醬香酒酒體的風格特征具有一定貢獻[2]。霉菌參與醬香型白酒的全部生產過程，如分泌高活性的糖化酶、液化酶、蛋白酶等，是白酒發酵原料中淀粉等大分子物質分解的主要動力之一[3]，并能為酵母菌的繁殖和發酵提供底物，轉化為乙醇和多種呈香風味物質，提升出酒率和優級品率[4]。王曉丹等[5]從遵義地區的醬香型大曲中分離1株產多種酶并同時產多種香氣成分的霉菌，是醬香大曲微生物組成中的重要霉菌之一。

由于醬香香味成分復雜，與原料的成分和菌種代謝產物有密切聯系，而且醬香型酒的特征性風味化合物研究尚未取得確切結果，嚴重制約了形成醬香風味的各種微量成分的深入研究與應用，嚴重影響醬香型白酒的科學理論發展，同時也限制了其生產規模的進一步擴大[6]。本研究從本地醬香高溫大曲中分離篩選出產醬香的霉菌菌株，并通過GCMS分析來確定霉菌對醬香型白酒風味的貢獻，為本地白酒后期相關研究提供借鑒，以期對改善酒體質量提供實際指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

本研究所用高溫大曲在駐馬店市西平縣某酒廠車間選取，大曲的采樣按“四分法”進行取樣，于-18℃儲存備用；所用高粱和麩皮皆為酒廠提供，保存于4℃冰箱中備用。

試劑：本研究所用試劑均為分析純及以上級別，溶液均由雙蒸水配制。

分離篩選培養基：馬鈴薯瓊脂培養基和察氏培養基[7]。

液體種子培養基：20 g蔗糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，1 L蒸餾水，加熱溶解，冷卻后調pH值至5.0～6.0，121 ℃滅菌20 min。

液體培養：菌株經平板活化后，挑取少量菌體接種于液體培養基中，以28℃、120 r/min搖床培養2～3 d。

固體培養基：30 g高粱粉加蒸餾水15 mL，加入250 mL三角瓶中攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

儀器設備：SHP-250FE型智能生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司；LDKM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；UB102i型生物顯微鏡，重慶奧浦光電技術有限公司；JB5374-91型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；6890N/5975B氣質聯用儀，美國安捷倫公司，75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌的分離純化培養

取已處理的大曲樣進行梯度稀釋（10-1～10-5），涂布在培養基上35℃培養48 h。挑取具有霉菌特征的單菌落進行純化培養，然后接種到馬鈴薯斜面培養基上，保存備用。

1.2.2 霉菌的鑒定

1.2.2.1 形態學分析

在光學顯微鏡下觀察菌絲及其孢子形態特征，結合真菌鑒定手冊[8]，進行霉菌種屬的初步判斷。

1.2.2.2 霉菌生理生化試驗[9]

霉菌碳源的利用：用不含碳源的察氏培養基，加入5%的果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖和乳糖分別培養，觀察霉菌利用碳源的生長情況。

霉菌氮源的利用：用不含氮源的察氏培養基，分別加入3%的尿素、硫酸銨、牛肉粉、大豆提取物、硝酸銨分別培養，觀察霉菌利用氮源的生長情況。

1.2.2.3 分子生物學鑒定

由江蘇金斯瑞生物科技有限公司完成，使用BLAST方法將測序結果與GenBank數據庫中已知真菌序列進行同源性分析。

1.2.3 霉菌固態發酵產物氣質分析

1.2.3.1 固態發酵產物的制備

無菌條件下，吸取10 mL液體培養基的菌株種子液，加入固態發酵培養基中，用棉塞塞緊瓶口，28℃恒溫發酵7 d。

1.2.3.2 固態發酵產物揮發性成分提取

頂空固相微萃取的操作步驟：將放置于冷凍室的樣品先在室溫下解凍，再取4 g或6 g（根據頂空瓶的容積大小提?。┕虘B發酵后的培養基加入頂空萃取瓶中，加蓋密封，在60℃恒溫條件下，先平衡10 min。將預先進行高溫老化（240℃，30 min）后的SPME針頭插入頂空樣品瓶，推出萃取纖維頭，頂空萃取30 min，隨后于GC-MS進樣口以240℃解析5 min[10-11]。

1.2.3.3 GC-MS條件[12]

色譜條件（GC）：J＆WDB-5石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以 He為載氣，恒定流速為1.0 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度240℃；程序升溫：初始溫度40℃，保持3 min；然后以5℃/min升至120℃，保持4 min，8℃/min的速率升溫到200℃，保持8min，10℃/min升至240℃，保持10min。

質譜條件（MS）：電離方式為EI，電子能量70 eV；發射電流：350 μA；接口溫度250 ℃，離子源溫度230℃；掃描質量范圍為33～450 u。

1.2.4 霉菌酶活的測定[13]

對分離篩選得到的霉菌進行果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶的測定并進行比較。

具體方法為將分離得到的霉菌在斜面養基上活化2次，再接種到斜面培養基上于30℃條件下培養7 d，在無菌條件下加入5 mL的滅菌生理鹽水，用移液器反復沖洗孢子呈孢子懸浮液，取1 mL孢子懸浮液加入已滅菌的麩皮培養基中。在30℃條件下培養72 h，每隔12 h搖勻1次。培養好后，取相當于10 g的絕干培養物于100 mL水中，在40℃水浴鍋中保溫1 h，每隔15 min攪拌1次，過濾，濾液為粗酶液，用于酶活測定。

2 結果與分析

2.1 分離純化及形態鑒定

利用稀釋平板涂布法對高溫大曲中霉菌進行分離純化，通過肉眼觀察對菌株的個體形態和菌落形態進行辨認，根據形狀、菌落表面干濕狀態、透明狀態、光澤度、顏色、附著程度篩選出1種菌落形態不同的菌株（B），如表1和圖1所示。

表1 霉菌宏觀形態描述

形態學觀察只能初步鑒別，需要進一步進行生理生化試驗及分子生物學分析，才能鑒定其種屬。

2.2 生理生化實驗結果

在碳源利用試驗中，B菌對麥芽糖的利用效果最好，其次是果糖和蔗糖。在氮源利用試驗中，B對牛肉粉、大豆粉、硝酸銨利用效果最好，其次是亞硝酸銨，對尿素的利用效果最差，如表2和表3所示。

2.3 分子生物學鑒定結果（圖2）

圖1 B菌株鏡檢圖片和菌落形態

表2 碳源利用結果

表3 氮源利用結果

為了對所篩選菌株做進一步鑒定，對系統發育樹進行了分析。結果顯示，菌株B與Aspergillus niger序列相似性最高，為99%，結合形態及生理生化特征，確定B菌株為黑曲霉，有學者曾對茅臺酒大曲中的微生物群落進行分離鑒定，結果表明，在茅臺酒生產過程中微生物群落極其復雜，包括大量霉菌，其中黑曲霉所占比例最高[14]。

2.4 固態發酵產物揮發性物質檢測結果

圖2 B菌株的系統發育樹

霉菌在發酵過程中所生成的高級醇、醛、酮、酯等呈香物質，是形成醬香酒風味物質及風味前體物質的重要來源[5]。本研究對霉菌進行了模擬固態發酵試驗，通過固相微萃取和氣相色譜分析技術，對固態發酵產物的揮發性香味成分進行測定并分析。結果表明，霉菌發酵產物中共檢測出43種成分，包括5種未知化合物。其中，檢測出的醛類物質有4種，占香氣成分的4.4%；醇類物質有5種，占香氣成分的9.29%；酸類成分有2種，占香氣成分的3.79%；酯類成分有4種，占香氣成分的2.72%；酚類成分有3種，占香氣成分的36.85%；呋喃類成分有2種，占香氣成分的5.86%；另外還有其他香味成分，如3-羥基-2-丙酮、乙苯、苯乙烯、塞舌爾烯等，占香氣成分的3.8%（表4）。

總的來說，酚類物質、醇類物質、呋喃類物質所占的比例最高，醛類物質、酸類物質、酯類物質和其他香氣成分所占比例較少。據此，我們推斷霉菌對固態發酵產物貢獻香味成分最多的物質是酚類、醇類和呋喃類。酚類物質中的2-甲氧基苯酚含量高達17.21%，呈現出較濃郁的甜香和木香。另外，愈創木酚含量也較高，高達14.88%。有研究發現，這種物質具有煙熏風味，是醬香型白酒中主要的酚類風味物質，同時具有抗氧化活性[15]。莫新良等[16]發現黃酒貯存期間，香草醛是4-乙烯基愈創木酚降解的主要產物，而香草醛具有甜香味。因此，含量較高的愈創木酚對后期白酒的陳化具有重要作用。楊玉波等[17]研究還發現苯乙醛和4-乙烯基愈創木酚的香氣活力值較高，是高粱蒸煮的重要香氣成分。

醇類的含量也較高，醇和酸會通過酯化反應大量合成酯類，會賦予白酒更多的香味物質，適量的高級醇能夠賦予白酒良好的感官特征。其中在醇類物質中仲丁醇的含量最高，呈現出類似葡萄酒的風味，其中乙醇的含量也較高，會呈現出類似玫瑰花和蜂蜜香味[18]。

呋喃類物質是白酒中一類重要的呈香物質[19]，本研究中檢測到的有2,3-二氫苯并呋喃和2-戊基呋喃2種物質，其中2-戊基呋喃是主要的呈果香物質，王曉丹等[5]從醬香型大曲中分離得到的霉菌中也發現此種物質[4]。

酸類、醛類、酯類等物質也是大曲中和白酒中的重要呈香物質，其中酯類化合物有花香和水果香，醛類呈現出水果香味[20]。酸類物質中的3-甲基丁酸有水果的香味，Fan等[21]對兩種醬香型白酒進行GC-O分析，發現3-甲基丁酸等是聞香強度最高的物質。另外，其他揮發性物質中3-羥基-2-丁酮的含量較高，有奶香味。徐丹等[22]對霉菌研究中發現，霉菌分泌的酶具有良好的蛋白質分解能力，如總狀毛霉的蛋白酶活力較高，還可產生醬香風味物質吡嗪類的前體物質3-羥基-2-丁酮。

2.5 霉菌酶活的測定結果

霉菌能夠分泌活力高的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等多種酶，是實現固態糖化發酵的關鍵微生物，在酒醅發酵過程中具有重要的功能，直接關系到原料的利用及白酒風味的形成，同時對大曲的成熟及風味有積極的貢獻[23-25]。

表4 揮發性成分中呈香物質及相對含量

表5 霉菌各種酶活力測定結果 (U/g)

本研究對醬香高溫大曲中的霉菌在固態釀造中起主要作用的酶進行了分析，發現黑曲霉的產酶活力都較高，如黑曲霉分泌的中性蛋白酶活力可達2372.57 U/g（表5）。蛋白酶在發酵過程中可以催化生成多種呈香物質，是醬香白酒風味物質及風味前體物質形成的重要酶類[26]。纖維素酶、α-淀粉酶和果膠酶的活力也較高，其中糖化酶的活力可達1059.13 U/g（表5），黑曲霉的糖化酶活力較高，有利于白酒釀造過程中縮短酒精發酵周期，提高酵母產酒能力，加強原料的利用率[27]。另外，黑曲霉是α-淀粉酶與酸性蛋白酶的主要來源，這兩種酶能在釀酒的高溫及酸或強酸性環境下發揮作用，還能產生活性較高的糖化酶[28]。黃永光等[29]研究發現，河內白曲也常出現在醬香大曲中，通過對它的分泌胞外蛋白進行研究，發現其能分泌釀酒所需的糖化酶、蛋白酶，提升出酒率與酒的品質。

3 結論

本研究采用傳統分離霉菌的方法對高溫大曲中的霉菌進行分離純化，成功篩選得到1株產香霉菌，利用形態學、生理生化試驗及分子生物學確定這種霉菌為黑曲霉；研究了該株霉菌固態發酵產物中各種揮發性成分以及各種酶的活性，發現酚類物質、醇類物質和呋喃類物質對風味的貢獻最大，另外黑曲霉分泌的蛋白酶活力較高，有利于提高高溫大曲在醬香白酒過程中的作用。研究結果為下一步探索霉菌在醬香型白酒風味物質形成中所起的作用奠定基礎。