玉米濃醪酒精發酵工藝的研究

張 強，袁旭東，卞文治，霍 昱，吳麗莎，張旭鵬，周維婧

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林長春130022）

隨著環境污染和能源危機的日益加劇，燃料酒精的生產引起了人們極大的興趣[1-2]。世界各國都在努力發展燃料酒精項目,但目前燃料酒精生產成本較高，缺乏有效的市場競爭力，因此降低生產成本對于燃料酒精工業發展具有重要的意義[3]。

提高發酵液中的酒精濃度是目前酒精行業主要的創新方法。濃醪酒精發酵技術具有提高發酵終點酒精濃度，降低能耗，節約工藝用水及蒸汽用量，縮短發酵周期等優勢，可實現高細胞密度、高產物濃度和高速率發酵，從而有效降低酒精生產中的各項費用，因此濃醪酒精發酵技術一直是酒精行業重要的研究方向[4]。目前濃醪酒精發酵中對高耐性釀酒酵母研究較多，而對發酵工藝研究相對較少。研究表明，濃醪酒精發酵過程中主要由于營養物質缺乏,而不是酒精的積累導致酵母發酵活性的降低。另外，高底物濃度會導致高滲透壓和低水活性,而高滲透壓則會抑制酵母生產的酒精向培養基中擴散，從而造成對酵母細胞的毒害作用。因此在濃醪酒精發酵條件下，加入適當的營養物質，有助于增強酵母的活性，提高發酵液中酒精濃度[5-6]。

本試驗采用釀酒酵母對玉米濃醪酒精發酵工藝進行研究。通過單因素及正交試驗確定適宜的料水比、糖化酶以及蛋白酶添加量，同時研究了營養物甘氨酸、脯氨酸以及肌醇對酒精發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：活性釀酒干酵母(ADY)，酒用耐高溫型，湖北安琪酵母股份有限公司生產。

酶制劑：糖化酶(100000U/g)，蛋白酶(100000U/g)，北京奧博星生物技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒精發酵試驗

稱取100 g玉米粉，加入適量的糖化酶、蛋白酶和酵母，按比例與自來水均勻混合于500 mL的三角瓶中，塞上發酵栓，放入振蕩培養箱內，30℃進行發酵。

1.2.2 還原糖含量測定

還原糖采用DNS法測定。

1.2.3 酒精濃度測定

準確量取紗布過濾或離心(300 r/min)的清液樣品100 mL于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，緩慢加熱蒸餾（沸騰后蒸餾時間應控制在30～40 min內），收集100 mL餾出液于100 mL容量瓶中，采用酒精計測定酒精濃度。

2 結果與分析

2.1 不同料水比（玉米粉∶水）對酒精發酵的影響

水是重要的反應物，沒有足夠的水參與反應，會使發酵反應不徹底。另外醪液濃度大小直接影響到基質中酶及酵母的代謝活性，最終影響酒精的濃度[7]。將玉米粉按料水比1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0、1∶2.2、1∶2.4進行充分混合,加入活化后的酵母,測定醪液中的酒精濃度和殘糖，結果如圖1所示。

圖1 不同料水比對酒精發酵的影響

從圖1可以看出，料水比對酒精發酵的影響非常明顯。外加的水較多,則底物的濃度相對較低,產生的酒精濃度也較低，同時對后期酒精蒸餾產生影響，增加能耗以及產生大量的酒精廢液。外加水較少，則反應很難進行或者產生的酒精濃度較高，高濃度酒精會對酵母菌產生毒害作用。從圖1可知，當料水比為1∶1.6時，不但酒精濃度較低，而且殘糖濃度也較高。而料水比為1∶2.4時，酒精濃度較低，不經濟。因此當料水比在1∶1.8至1∶2.2時,酒精濃度較高，殘糖較低，適合酒精發酵。

2.2 糖化酶添加量對酒精發酵的影響

發酵過程中糖化酶添加量的多少直接影響到發酵的結果，通過添加適量的糖化酶，可使糖化和發酵同步，使發酵液中還原糖始終處于較低水平，從而有利于提高發酵液中的酒精濃度[8]。以糖化酶添加量分別為0 U/g、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g，活性干酵母接種量為0.2%，料水比1∶2的發酵工藝，考察了糖化酶添加量對酒精得率的影響，結果見圖2。

圖2 糖化酶添加量對酒精發酵的影響

由圖2可知，由于采用同步糖化發酵模式，在糖化酶作用下，生成的還原糖不斷被菌體利用，酒精生成量不斷增多。但隨著糖化酶添加量增大，酒精產量反而有所降低，可能由于糖化產生的葡萄糖速度較快，沒有完全被菌體利用產生酒精，而生成了一些其他副產物。另外高糖濃度具有高滲作用，也會抑制菌體生長代謝，影響酒精產量[9]。當糖化酶添加量為50～150 U/g（原料）時，酒精濃度較高，發酵結束時還原糖濃度也處于較低水平，表明糖化作用與菌體代謝作用相協調，從而獲得了較高的酒精濃度。

2.3 蛋白酶添加量對酒精發酵的影響

在酒精發酵生產過程中,大多數糖化醪中氮源含量低,酵母菌無法較好的生長,所以必須額外添加氮源。添加蛋白酶可以釋放出容易被酵母利用的氨基酸,提高酵母的發酵活力。另外可降低發酵液的黏度，有利于發酵順利進行[10]。選用蛋白酶添加量分別為0 U/g、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g，活性干酵母接種量為0.2%，料水比1∶2，糖化酶添加量100 U/g的發酵工藝，考察了蛋白酶添加量對酒精得率的影響，結果見圖3。

圖3 蛋白酶添加量對酒精發酵的影響

由圖3可知，過高的蛋白酶添加量，往往不利于酒精發酵，反而導致酒精濃度有所降低，可能由于豐富的營養物質會引起菌體過快生長，從而不利于酒精形成。當蛋白酶添加量為100～200 U/g（原料）時，獲得了較高的酒精濃度。

2.4 正交試驗

在糖化酶、料水比以及蛋白酶單因素試驗的基礎上，選取糖化酶添加量、料水比以及蛋白酶添加量3個因素，每個因素選擇3個水平（見表1），以發酵液中酒精濃度作為考察指標，正交試驗結果如表2所示。

表1 正交試驗設計表

表2 正交試驗結果

由正交試驗結果的極差分析可知，極差越大，表明該因素對酒精濃度的影響越大，該因素越重要。因此，糖化酶添加量＞料水比＞蛋白酶添加量。另外從表3的方差結果分析可知，在所考察的3個變量中，糖化酶添加量對酒精發酵的影響最為顯著，料水比以及蛋白酶添加量次之。

表3 方差分析

綜合以上各因素，玉米濃醪酒精發酵過程中，以糖化酶添加量為100 U/g(原料)，料水比為1∶2，蛋白酶添加量為150 U/g(原料)為最佳工藝條件。按上述工藝條件，進行3次平行驗證試驗，最終酒精濃度為16.8%vol。

2.5 添加營養物質對濃醪酒精發酵的影響

Casey[11]認為，營養物質是酵母菌生長及代謝的重要物質,如果能夠滿足菌體的營養需要,可促進酒精發酵速度和增加酒精濃度。培養基是酵母菌營養和能量的來源，在發酵過程中起著非常重要的作用[12-13]。大量研究發現，在培養基中加入適量的營養物質，如甘氨酸、脯氨酸和肌醇等，都可以有效提高酵母菌產酒精能力[14-15]（圖4、圖5、圖6）。

圖4 甘氨酸濃度對酒精發酵的影響

圖5 脯氨酸濃度對酒精發酵的影響

圖6 肌醇濃度對酒精發酵的影響

由圖4、圖5、圖6可知，營養物質甘氨酸、脯氨酸和肌醇都能有效提高菌體酒精耐受性能，從而提高酒精產量。當甘氨酸添加濃度為2 g/L，脯氨酸添加濃度為3 g/L，肌醇添加濃度為4 g/L時，發酵終點酒精濃度最高,分別為17.7%vol、17.5%vol和17.4%vol，且均高于空白對照組。但甘氨酸的促進作用強于脯氨酸和肌醇。而當甘氨酸、脯氨酸及肌醇添加濃度分別偏離2 g/L、3 g/L和4 g/L最適濃度時，發酵酒精濃度明顯下降。

3 結論

經過上述實驗，可以初步得到如下結論：添加適量的糖化酶和蛋白酶以及適宜的料水比可以有效提高發酵液酒精濃度，實現濃醪發酵。當糖化酶和蛋白酶添加量分別為100 U/g（原料）和150 U/g（原料），料水比為1∶2時，酒精濃度達到16.8%vol。

另外，添加營養物質甘氨酸、脯氨酸以及肌醇都能有效提高酒精濃度，但甘氨酸添加效果優于脯氨酸和肌醇。當甘氨酸添加濃度為2 g/L時，發酵液酒精濃度達到17.7%vol。發酵過程中，甘氨酸和脯氨酸由于結構的特殊性，通常不是作為酵母生長的氮源，主要作為酵母的滲透壓保護劑。肌醇是磷脂的重要組分，而磷脂又是細胞膜的最重要成分，所以肌醇在提高酵母酒精耐受性方面起著重要的作用。