彝族小曲酒香氣成分的分析研究

母應春，姜 麗，蘇 偉

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

小曲酒主要是以高粱為原料，但也有用玉米、小麥等，以小曲為糖化發酵劑，經糖化與發酵再經固態或液態蒸餾而生產的酒[1]，具有清香純正、醇甜柔和、自然協調的特點[2]。清香型小曲酒的香味組分以酯類和醇類為主，其次是有機酸和羰基化合物，其中乙酸乙酯含量占總體酯類物質的50%以上，是構成清香型小曲酒清香純正、香氣協調的主要成分[3-4]。揮發性酚類物質是白酒中的重要香味物質，這一類物質對于酒的聞香、口味以及穩定性等方面均具有重要的作用[5-6]。揮發性酚類物質在白酒中的形成途徑可能是發酵原料中的木質素降解或一些氨基酸在微生物作用下產生[7]，這類化合物在閾值范圍內都具有特殊的香氣。

彝族小曲酒采用具有地方特色的原料加小曲糖化發酵釀制而成，感官上具有與清香型小曲酒相似的主要香氣成分，在當地頗受歡迎。但是至今還未出現關于彝族小曲酒的香氣成分報道，有關彝族小曲酒香味形成的主要物質也尚未得到具體的研究。本文采用固相微萃取（SPE）結合氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀對彝族小曲酒Y1、Y2和R1的香氣成分進行定性半定量檢測及揮發性酚類物質的定性定量檢測比較分析，以期為彝族小曲酒的工業化生產和穩定化發展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：彝族小曲酒Y1、Y2（原料為高粱與玉米）、R1（原料為高粱），采集于貴州省當地酒廠。

試劑：無水乙醇（色譜純，美國天地公司）；乙酸丁酯（購于國家標準物質中心）；三氯甲烷(色譜純，美國天地)；愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚、2,3-二氫苯并呋喃、對乙基苯酚、苯酚、2-甲酚、對甲苯酚、間甲苯酚(德國DR)。

儀器設備：氣相色譜質譜聯用儀（Trace GC Ultra-DSQ MS，美國賽默飛世爾）；C18固相萃取柱(1000 mg/6 mL，美國沃特世)。

1.2 試驗方法

1.2.1 香氣物質的測定

用固相微萃取法（Solid-phase Microextraction,SPE）萃取Y1、Y2、R1中的揮發性成分，再用氣相色譜-質譜聯用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer）對其進行分離和鑒定。揮發性成分提取：根據李俊等方法[8]，量取5 mL酒樣加入0.5 mL乙酸丁酯內標溶液，充分混勻后用于GC-MS分析，且在同等條件下測定并建立標準曲線。

色譜分析：樣品通過色譜柱（HP-FFAP 50 m×200 μm，0.33 μm）進行分離；程序升溫：50 ℃（1 min）；以6℃/min升溫到80℃（2 min）；再以6℃/min升溫到200℃（5 min）；再以20℃/min升溫到220℃（5 min）；進樣口溫度(250 ℃)；載氣：He；流速：1.0 mL/min；樣液進樣量：1.0 μL。

質譜條件：離子源溫度：250℃；EI電離源；電子能量：70 eV；SIM模式掃描。對采集得到的各峰經質譜計算機數據系統檢索，核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。

1.2.2 揮發性酚類物質測定

依次用水、乙醇5 mL活化C18固相萃取柱，準確吸取25.0 mL酒樣，加入25.0 mL蒸餾水混勻后，以5 mL/min的速度連續進樣到C18柱，再用氮氣將C18固相萃取柱吹2 min，完成樣酒在C18柱上的富集，最后用5 mL三氯甲烷∶甲苯(v∶v=90∶10)洗脫萃取柱，收集濾液定容至5 mL，供GC-MS分析。

色譜分析：DB-FFAP石英毛細柱(50 m×0.250 mm，0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持1 min，以6.0℃/min升溫到200℃保持5 min，再以20℃/min升溫到210℃保持10 min；載氣(He)流速1 mL/min；進樣口溫度(230 ℃)；進樣量1.0 μL。

質譜條件：傳輸線溫度：230℃；離子源溫度：230℃；EI電離源；電了能量：70 eV；SIM模式掃描。對采集得到的各峰經質譜計算機數據系統檢索，核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。

1.3 統計分析

實驗數據分析與處理采用SIMCA 13.0和Origin 8.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 小曲酒的主要香氣成分及相對含量

香氣成分是決定酒樣的香氣、口感和風格的關鍵因素[9]。對Y1、Y2、R1 3種小曲酒進行GC-MS測定分析，其香氣成分GC-MS總離子流圖和各香氣成分相對含量的鑒定結果見圖1—圖4和表1。

圖1 彝族小曲酒Y1香氣成分總離子流圖

從表1可以看出，通過GC-MS檢測并經譜庫（NIST）檢索共檢測出26種香氣成分，醇類8種、酯類7種、酸類8種、醛類3種。

圖2 彝族小曲酒Y2香氣成分總離子流圖

圖3 小曲酒R1香氣成分總離子流圖

在Y1所測得香氣成分中，醇類占總含量的32.28%，酯類占47.97%，酸類占16.43%。其中主要香氣成分為異戊醇（23.12%）、正丙醇（5.95%）、異丁酸乙酯（26.81%）、丁酸乙酯（17.7%）、乙酸（15.74%）和乙醛（2.67%）。

在Y2中，醇類占總含量的29.5%，酯類占52.07%，酸類占12.78%。其中主要香氣成分為異戊醇（24.31%）、異丁酸乙酯（28.69%）、丁酸乙酯（19.53%）、乙酸（11.56%）和乙醛（4.23%）。

在R1中，醇類占總含量的23.45%，酯類占44.74%，酸類占19.43%。其中主要香氣成分為異戊醇（10.85%）、異丁醇（9.5%）、乳酸乙酯（16.75%）、異丁酸乙酯（15.83%）、丁酸乙酯（10.68%）、乙酸（18.19%）和乙醛（7.84%）。

2.2 不同小曲酒樣香氣成分整體結構的差異分析

主成分分析是無監督分析，能反映數據整體最原始的情況[10]，而正交偏最小二乘法（OPLS-DA）是人為加入分組變量的有監督分析，能強化組間差距并發現剔除異常樣品[11]。在對小曲酒Y1、Y2、R1香氣成分差異性分析的基礎上，采用主成分分析法、正交偏最小二乘法和單因素方差分析等多元統計學方法對小曲酒Y1、Y2、R1整體結構品質進行差異性分析，并篩選出影響小曲酒Y1、Y2、R1整體結構品質差異顯著相關的指標。

表1 小曲酒Y1、Y2、R1香氣成分及相對含量表

圖4 3種小曲酒PCA分析圖

圖5 3種小曲酒OPLS-DA分析圖

通過圖4可以看出，小曲酒Y1、Y2分別與R1分布于Y軸不同側，而Y1與Y2都分布在同側，說明Y1、Y2分別與R1組間差異非常明顯，而Y1與Y2差異明顯。Y1、Y2是原料為高粱和玉米的彝族小曲酒，而R1是原料為高粱的小曲酒，這說明由于Y1、Y2與R1的原料不同而導致其香氣成分整體結構的差異非常顯著，且因為彝族小曲酒生產技術相對落后，導致酒質不統一而造成Y1與Y2的差異。

為了消除組內間的差異，進一步采用正交偏最小二乘法分析，如圖5所示，Y1分布于第二象限，Y2分布于第一象限，R1分布于第三象限，在消除了組內差異后，Y1、Y2、R1的香氣成分整體結構的差異情況非常明顯。結合圖6可以定性的認為，小曲酒Y1、Y2香氣成分中正丙醇、異戊醇、丁酸乙酯和異丁酸乙酯含量明顯高于R1；R1香氣成分中乙酸、乳酸乙酯、乙醛含量明顯高于Y1、Y2。

由圖6可知，與主成分相關系數越大的指標離中心就越遠，而相關系數的絕對值越大，則表明指標與主成分聯系越緊密[12]，因此圖6中黑色圓點所代表的物質與主成分聯系緊密。篩選出的與主成分聯系緊密的7種物質分別為正丙醇、異戊醇、乙酸、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙醛。

圖6 OPLS-DA載荷圖

圖7 OPLS-DA VIP圖

無論是PCA分析圖還是OPLS-DA分析圖，都只能宏觀表現出Y1、Y2、R1間香氣成分整體結構的差異情況，而OPLS-DA載荷圖和VIP圖（圖7）則是代表了其中全部物質所占的權重，差異權重越大，VIP值越大，載荷圖中的點離中心越遠[13]。而VIP值大于1的指標和載荷圖中偏離中心較遠的點一致，將上述7個篩選出的差異性顯著的物質經過SPSS 23.0進行單因素方差分析驗證，經驗證該7個物質均為差異顯著物質（P＜0.05）。VIP值見表2。

表2 OPLS-DA VIP值表

2.3 不同小曲酒樣差異顯著物質的分析

將上述7個差異顯著香氣成分及其含量導入Origin 8.0作SD柱形圖（圖8）。

由圖8可知，7個差異性顯著的香氣成分中，小曲酒Y1、Y2含量明顯大于R1的有：

圖8 7種差異顯著物質的SD柱形圖

①正丙醇：正丙醇、異戊醇、異丁醇、仲丁醇等高級醇是構成雜醇油的主要成分，但也是白酒重要的呈香呈味物質之一[14]。雜醇油是白酒中苦澀味的主要來源之一[15]，當飲用酒中雜醇油含量過高時，會對人體造成麻醉及中毒，使人感到頭暈頭痛。國標規定白酒中雜醇油含量不得超過150 mg/100 mL。由圖8可知，3組小曲酒均未超標。高級醇尤其是正丙醇在一定的濃度范圍內，會出現類似清香型小曲酒所特有的落口后干爽帶苦的特點，Y類酒的正丙醇含量明顯高于R1，文獻表明正丙醇含量與清香型小曲酒的干爽帶苦有直接關系[16]，由此說明Y1、Y2具有清香型小曲酒的部分風味特征。但Y1與Y2中正丙醇含量也存在較大差異，酵母菌在固態發酵中是正丙醇的主要產生菌，酵母菌總數與正丙醇含量成正相關[17]，所以推測Y1與Y2出現差異的原因是在發酵階段，原料工藝相同的Y1、Y2因為生產規模小，設備簡單，監管力度不夠而導致彝族小曲酒的品質有所差異。

②異戊醇：根據國標對雜醇油含量的規定可看出，Y1、Y2中異戊醇含量都略微超標。白酒中適量的高級醇能襯托酯香并賦予酒特殊香氣，使香氣更完美[18]。雜醇油的生成原因是由于原料中蛋白質水解為氨基酸，氨基酸再經酵母或糖化菌分泌的脫羧酶和脫氨基酶的作用而生成與氨基酸相應的雜醇油[19]，而Y類酒是玉米與高粱混合釀造，R1是高粱釀造，所以推測是因為彝族Y類酒中玉米與高粱為原料其蛋白質含量高于R1而導致異戊醇含量差異極大。

③丁酸乙酯、異丁酸乙酯：丁酸乙酯具有蘋果香氣[20]，與異丁酸乙酯可以相互烘托，丁酸乙酯閾值低，對口感影響大[21]，適量的丁酸乙酯可賦予酒爽口的風味，但過多則會產生脂肪臭味。Y類酒丁酸乙酯含量高于R1，又由于其閾值低，對彝族小曲酒口感的影響可能很大。其可能是由于彝族小曲酒原料為高粱與玉米，在發酵過程中玉米胚芽所含有的占原料重量5%左右的脂肪因氧化而容易產生異味帶入酒中。

7個差異性顯著的香氣成分中，R1含量明顯高于Y1、Y2的有：

①乳酸乙酯：乳酸乙酯與乙酸乙酯都是清香型小曲酒的特征成分，乳酸乙酯含量過低會使酒體香氣寡淡，使酒后味短[22]；由于乳酸乙酯沸點較高，若乳酸乙酯含量過高或超過乙酸乙酯含量，會使乙酸乙酯揮發性降低，對乙酸乙酯放香有一定的抑制作用[23]。由圖8可看出，添加了玉米為原料的彝族小曲酒對比高粱為原料的小曲酒，其乳酸乙酯含量明顯降低，可能是由于產生乳酸乙酯的是乳酸菌，其對玉米胚芽中的脂肪起到了一定的分解作用而導致生成的乳酸乙酯含量降低。

圖9 彝族小曲酒Y1揮發性酚類物質總離子流圖

圖10 彝族小曲酒Y2揮發性酚類物質總離子流圖

圖11 小曲酒R1揮發性酚類物質總離子流圖

表3 Y1、Y2、R1揮發性酚類物質含量表

②乙酸：乙酸是可利用的糖在醋酸菌的轉化下生成的，而在清香型白酒中有機酸里乙酸的含量最高，但若酸類物質含量過高，會使酒質口感粗糙，產生雜味，降低酒質[24]。所以Y1、Y2的口感優于R1，但Y1與Y2之間也出現了差異，其可能原因是彝族小曲酒生產品質不穩定造成的。

③乙醛：乙醛有較強的刺激性氣味，因沸點低、易揮發而有助于白酒放香，少量乙醛是白酒中有益的香氣成分，它與正丙醇共同組成了清香型小曲酒爽口帶苦的特點[25-26]。

2.4 不同小曲酒中揮發性酚類物質分析

通過氣相色譜-質譜(GC-MS)分析了Y1、Y2、R1中的揮發性酚類物質，為了酒樣檢測的穩定性排除其他因素干擾，每個樣品做3次平行檢測。實驗中所有的數據都是3次重復所得，以平均值±標準差表示（見圖9、圖10、圖11、表3）。

因為Y1、Y2、R1原料中都含有高粱，而高粱外殼中獨有的單寧為復雜的高分子多元酚類化合物[27]。在發酵過程中會帶入酒中，因而使酒中酚類物質含量較高。

由表3可知，在Y1、Y2、R1中揮發性酚類物質含量都相對較低，但Y類酒所測得的揮發性酚類物質種類與含量都多于R1小曲酒。揮發性酚類物質雖然含量很少，但呈香作用很大，它在百萬分之一，甚至千萬分之一的情況下就能使人感到強烈的香味[28]。其中4-乙基愈創木酚其主體為香蘭醛、阿魏酸及香蘭酸[29]，香蘭醛有香草豆的特殊香氣，具有世界性嗜好的一種非常愉快的清香味，能在酒中產生甜味；阿魏酸有輕微的香味和辛味，可以轉變成香蘭醛和香蘭酸[30]；香蘭酸雖然香味不及香蘭醛，但香味柔和，是很好的助香劑[31]。R1中僅檢出微量4-乙基愈創木酚，而Y類酒中不僅有且含量較高，所以彝族小曲酒Y1、Y2在此方面的風味特征優于小曲酒R1。

3 結論

采用GC-MS技術分析不同小曲酒的香氣成分，3種小曲酒樣中共檢測出香氣成分26種，其中在彝族小曲酒Y1、Y2和R1小曲酒中分別檢測出25種、24種、25種芳香化合物。用色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分在3種酒樣中的相對含量，由分析可知，3種酒樣香氣的差異主要表現在香氣成分相對含量上；其中酯類化合物含量最高，分別占總成分的47.97%、52.07%、44.74%。通過對樣品香氣成分進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），統計結果表明，正丙醇、異戊醇、乙酸、乙醛、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯7種物質對小曲酒的香氣物質總含量的貢獻較大。不同原料生產的小曲酒中香氣物質的相對含量和揮發性酚類物質存在顯著差異，彝族Y類小曲酒中的揮發性酚類物質種類與含量都多于R1小曲酒。此外，彝族小曲酒Y1、Y2之間的香氣成分和揮發性物質相對含量也存在差異，可能是由于生產技術相對落后導致酒質不統一。