原核生物轉錄組研究的現狀與進展

劉夢圓 冷艷 翟立翔 何麗芳 李師翁

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，蘭州 730070）

近年來，隨著DNA高通量測序技術的快速發展和測序成本的大幅度降低，基于DNA測序技術的轉錄組學研究已經廣泛應用生物學研究之中。利用轉錄組技術挖掘功能基因是目前最主要的研究方向，是基因功能及結構研究的基礎和出發點。轉錄組測序技術首先被應用于真核生物的基因表達研究，由于原核生物RNA并不生成mRNA，因而其轉錄組研究起步較晚，但隨著RNA測序技術的突破，近年來，原核生物轉錄組研究發展很快，特別是在致病細菌的致病機理的研究，細菌基因表達對環境脅迫的響應機制，細菌降解環境污染物的分子機制等方面的研究，受到更為廣泛地關注，取得了許多重要的研究成果。

1 轉錄組技術概述

轉錄組的概念是由Charlles Auffary于1996年提出［1]，并于1997年首次在文章中被使用。轉錄組是某一個生物個體、組織或細胞在某一特定的時間或特定環境條件下表達的完整的或近乎完整的轉錄本的總和。研究轉錄組對于了解基因組功能及其代謝機理至關重要［2]。目前，常規的轉錄組測序分析流程可分為實驗設計與上機測序。實驗設計包括樣品的采集和保存、總RNA的提取、RNA質檢、目的RNA的富集、cDNA的合成及文庫構建。測序后的數據分析包括數據預處理、序列分析與轉錄本識別、轉錄本定量與功能分析、差異基因篩選、差異基因功能和代謝通路富集分析、差異基因表達分析以及差異基因功能注釋等。

2 原核生物轉錄組研究現狀

原核生物暴露于各種環境之中，營養限制、溫度、pH、氧氣、壓力、有機溶劑、重金屬、抗生素及其他微生物的存在與關系等，直接地作用于或影響原核生物。原核生物通過調節相應的基因表達以應對環境的變化與環境壓力。因此，轉錄組分析能夠準確有效地揭示原核生物響應環境的機制。

表1 細菌響應重金屬的轉錄組研究

2.1 細菌降解污染物的轉錄組研究

2.1.1 細菌響應重金屬的轉錄組研究 重金屬污染是一個重大的環境問題，利用微生物去除或減少土壤或水體中重金屬污染，由于其低成本和生態友好的性質，目前成為研究的熱點。微生物可以通過氧化還原作用改變特定金屬價態，降低重金屬的生物可利用性或潛在的毒性［3]。轉錄組技術揭示了細菌作用于重金屬的機制（表 1）。在 Ag（I）、Pd（II）和Se（IV）脅迫下，Pantoeasp. IMH顯示了對所有金屬相同的抗性機制，即多重抗應激蛋白BhsA和谷胱甘肽的解毒代謝。陽離子金屬（Ag+和Pd2+）的抗性機制主要是鋅轉運蛋白和硫酸鹽代謝，而草酸轉運蛋白和砷的抗性機制則具體參與了對陰離子（SeO32-）的抗性和還原。此外，推測Ag（I）可通過葡萄糖作用轉化為AgNPs，細胞色素CpxP參與Pd（II）的還原。研究結果為 Ag（I）、Pd（II）和 Se（IV）的耐藥和降低機制提供了新的線索［4]。

Cr（VI）具有高可溶性和毒性，長期接觸會導致突變和致癌。Cr的另一種最穩定、最常見的形式Cr（III）被認為毒性小于 Cr（VI），然而 Cr（III）會引起DNA損傷，抑制細菌拓撲異構酶DNA弛豫激 活。Staphylococcus aureusLZ-01具 有 將 Cr（VI）有氧還原為Cr（III）的能力。轉錄組測序分析表明，編碼硫氧還蛋白還原酶的基因和細胞色素c氧化酶復合物的主要亞基在Cr（VI）處理后均上調。29個abc型金屬/多藥轉運體和外排泵被上調，表明它們通過將Cr+泵出細胞來參與Cr（VI）抗性。26個DNA修復基因的上調說明Cr（VI）對DNA具有毒性，這些DNA保護蛋白需要對Cr（VI）應激作出反應［5]。Cr（VI）處理Shewanella oneidensisMR-1 24 h后培養上清液中未檢測到殘留Cr（VI），說明細胞完全吸收和/或還原了這種金屬。轉錄組和蛋白組分析發現，基因和蛋白表達譜的差異包括編碼鐵結合和轉運功能的基因的下調或低水平誘導（2-4倍）［6]。

2.1.2 芳香族化合物降解菌的轉錄組研究 了解降解的分子機制對制定有效的生物修復策略至關重要。近年來，有機污染物降解細菌的轉錄組學研究日益增多（表2）。多環芳烴在人類影響的環境中普遍存在［19]，這可能與代表性污染源（如高溫燃燒、交通排放、生物質燃燒）的大量釋放［20]和各種分散過程有關。環境中的多環芳烴有很大一部分可以被微生物去除，多環芳烴的微生物降解已經成為一種重要的修復技術［21-22]。轉錄組和蛋白質組學分析揭示了Bacillus subtilis對芳香族化合物的代謝機制，發現yfiDE（catDE）操縱子編碼一種兒茶酚2，3-雙加氧酶，這種酶是由兒茶酚強烈誘導的。yodED（mhqED）、ydfNOP（mhqNOP）操縱子和ykcA（mhqA）編碼對苯二酚特異性的外二醇加雙氧酶［21]。Rhodococcus jostiiRHA1能降解多氯聯苯（PCB），轉錄組分析發現該菌株具有6個新ORFs參與促進PCB代謝，其中Ro10225蛋白對RHA1中PCB/聯苯雙氧合酶復合物的形成至關重要［22]。Corynebacterium jeikeiumK411降解香草醇的轉錄組分析發現，4-羥基-3-甲氧芐醇可導致95個基因的差異表達，其中86個基因上調，耐藥決定因子cmx和預測的毒力因子sapA和sapD的表達水平顯著提高。Mycobacteriumsp. A1-PYR降解不同多環芳烴的轉錄組分析表明，3種多環芳烴降解酶在二元底物中的表達水平明顯高于僅在吡咯底物中的表達水平［23]。這些酶構成了一個完整的酶系統，實現了PYR的所有轉化步驟，其大部分編碼基因在A1-PYR菌株的基因組中形成了一個新的基因級聯，為微生物降解難降解的多環芳烴與易降解的多環芳烴共代謝提供了分子視角。氯脲-乙基是一種典型的長期殘留磺脲類除草劑，長期滯留對輪作作物危害很大。微生物降解被認為是最可接受的去除方法，但其降解機理尚不清楚。R.erythropolisD310-1是氯霉素-乙基高效的降解菌，轉錄組結果表明，菌株D310-1在氯霉素-乙基降解過程中上調了500個基因。主要KEGG代謝途徑為甲苯降解和氨基苯甲酸酯降解［24]。

2.1.3 石油烴降解菌的轉錄組研究 烴類屬于致癌物質和神經毒性有機污染物［25]。已經發現超過了200種的微生物可以降解石油烴［26]，79個種屬的細菌可以利用烷烴作為唯一的碳源和能源［27]。將Acinetobacter venetianusRAG-1分別培養在十二烷、十二烷醇和醋酸鈉中，比較分析發現了3個編碼烷烴氧化的基因alkMa、alkMb和almA，其中alkMb的差異表達最顯著，參與了十二烷的氧化。與醋酸鈉培養基上生長的菌株比較，篩選出1 074個差異表達基因，其中622個基因上調，這些基因與烷烴的分解代謝和應激反應有關［28]。紅黏土促進A.oleivoransDR1降解十六烷，其參與氧化應激防御相關及上下游代謝的基因上調，表明紅黏土提高DR1十六烷利用過程中產生的氧化應激的反應［29]。A.sp. HZ01可以降解蒽、菲、芘、正構烷烴等，利用多環芳烴作為唯一碳源。菌株HZ01在石油處理16 h，轉錄組分析篩選到742個差異基因，大部分下調基因與細胞運動性、糖代謝和編碼核糖體蛋白有關。而脂肪酸代謝途徑和部分單加氧酶、脫氫酶被激活，但TCA循環不活躍。末端氧化是菌株HZ01降解正構烷烴的主要好氧途徑［30]。

2.2 致病菌的轉錄組研究

表2 有機污染物降解細菌的轉錄組研究

開展原核生物轉錄組研究最多的是致病菌（表3），轉錄組已經成為研究宿主-病原菌相互作用復雜性的有效方法。深入了解致病菌的代謝途徑從而更好地實時控制，致病菌耐藥機制的研究對新藥研發提供有力依據。轉錄組分析發現鏈霉素依賴菌株Mycobacterium tuberculosis18b可以作為LTBI模型，并為結核桿菌的進化和核糖體的功能提供了見解［52]。轉錄組分析了鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium對氟喹諾酮的耐藥機制，耐藥性菌株TN4和TW4他們出現了大量差異表達基因，其中28個與耐藥相關，26個與兩個耐藥菌株的雙組分系統相關，TW4的輸出泵基因差異表達比TN4更強烈［53]。在體外培養條件下鰻弧菌Vibrio anguillarumM3生長中后期代謝途經相關的基因有3 159個，其中129個為新基因［54]。對鰻弧菌轉錄組研究增強了我們對于其致病力的了解。耐寒產單核李斯特菌Listeria monocytogenes轉錄組和代謝組分析發現參與合成支鏈脂肪酸的9個基因及內蛋白A、D基因等都表達上調［55]。轉錄數據提供了關于L.monocytogenes單核細胞基因冷誘導膜成分變化、其冷應激調控因子生長階段依賴性以及反義轉錄本在調節其冷應激反應中的積極作用的新信息。該研究增加了我們對李斯特菌的冷應激反應知識的了解，有助于在食品供應鏈中對其進行更有效的控制。

表3 致病菌的轉錄組研究

3 展望

轉錄組是研究表達的RNA轉錄本功能的，對于解密基因組的功能復雜性及更好地理解生物體的活動，包括發育、免疫防御和應激反應是至關重要的。目前，對于細菌的生理機制研究已擴展到分子層面，利用轉錄組分析的結果，挖掘出降解功能基因及其代謝通路，構建基因工程菌，進一步提高生物修復的效率。隨著基因組學及轉錄組學研究日益積累，研究人員利用組學數據實現了從更深層面對細菌作用機制的探索。另外，數據共享也加速推進組學研究。近年來對于極端環境的探索也在不斷開拓，極端環境存在著豐富的微生物資源，有望在未來的研究中發現更多的微生物，并通過轉錄組層面研究，對其生長代謝機理進行更深層面的挖掘。目前，高通量測序技術已經發展到第三代，相信在不遠的將來，轉錄組研究會越來越普遍，為科學研究帶來幫助。