非洲豬瘟病毒結構蛋白在病毒感染過程中的作用

歐云文 劉俐君 代軍飛 馬炳 張永光 張杰

（1. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046；2. 開江縣動物疫病預防控制中心，達州 636250；3. 達州市動物疫病預防控制中心，達州 635099）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、出血性豬傳染病，急性感染死亡率為100%［1]。急性和亞急性ASF常在多種器官上表現出嚴重的血管性病變，如腎臟出血、淋巴結彌漫性出血、肺水腫、彌散性血管內凝血和血小板減少等。其主要臨床癥狀是高熱、皮膚發紺、有出血點、嘔吐和便血等［2]。因此，ASF被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的法定動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫病［1]。1921年，在非洲（肯尼亞）首次發現ASF。1957年，歐洲（葡萄牙）首次暴發ASF疫情，隨后蔓延到全球多個國家和地區，如俄羅斯、烏克蘭、愛沙尼亞、拉脫維亞、波蘭等東歐國家和高加索地區［3-8]。2018年以來，全球有波蘭、俄羅斯、拉脫維亞、捷克、羅馬尼亞、摩爾多瓦、烏克蘭、匈牙利、保加利亞、比利時、科特迪瓦、南非、贊比亞和中國等14個國家發生ASF疫情，國際疫情形勢十分嚴峻［9]。2018年8月，遼寧省出現我國首例ASF疫情［10]。截至目前，在全國23個省（市、自治區）先后發生100起疫情，給我國養豬業造成嚴重的經濟損失。

ASFV是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是唯一蟲媒DNA病毒［11]。家豬、野豬和軟蜱均為ASFV的宿主，豬單核細胞-巨噬細胞為ASFV主要的靶細胞［12-13]。病毒基因組全長約為170-193 kb，基因組中間是一段長度約為125 kb的保守區［14-15]。基因組擁有150-167個開放閱讀框（ORFs），編碼150-200種蛋白質，其中約50種為結構蛋白［16]，主要結構蛋白有pp220、pp62、p72、p54、p22和CD2v蛋白等。ASFV粒子由病毒類核、內核芯殼、內囊膜、衣殼和外囊膜中由內向外組裝而成［16]。結構蛋白作為病毒粒子的主要成分，在ASFV吸附、侵入和復制等感染過程中起作用［16-17]。因此，本文綜述了ASFV結構蛋白在病毒感染中的作用，以期為ASFV結構蛋白的進一步研究提供參考。

1 內核芯殼蛋白

1.1 pp220和pp62蛋白

ASFV粒子直徑為170-190 nm，是由病毒類核、內核芯殼、內囊膜、衣殼和外囊膜組成復雜的多層結構，核心結構直徑為70-100 nm，包括病毒基因組、編碼酶和被組裝成病毒顆粒的蛋白質［16]。pp220和pp62蛋白為ASFV多聚蛋白前體，分別由CP2475L和CP530R基因編碼，屬于病毒感染過程中的晚期蛋白質。pp220蛋白含有多個蛋白酶水解靶基序，在Gly-Gly-X（任意）氨基酸序列水解位點，病毒編碼的SUMO樣S273R蛋白酶將pp220水解為成熟的病毒粒子蛋白p150、p37、p14和p34。因此，成熟的病毒粒子中不含pp220蛋白。按照相似的機理，pp62被水解為p35和p15蛋白［17]，S273R蛋白酶作為ASFV編碼蛋白，也是病毒粒子內核芯殼蛋白之一［18-19]。多聚蛋白水解產物主要位于病毒粒子內核芯殼，約占病毒蛋白總量的30%，是內核芯殼的主要成分，pp220、pp62的水解與病毒粒子的組裝是同時進行，該類蛋白的水解產物在病毒衣殼的組裝過程中起關鍵作用［20-21]。有學者研究發現，病毒顆粒主要聚集在靠近細胞核的離散細胞質區域，該區域又被稱為“病毒加工廠”，pp220蛋白則位于“病毒加工廠”之中［22]。有學者進一步研究發現，多聚蛋白pp220和pp62的加工需要病毒衣殼蛋白p72的表達，當p72表達受阻時，未加工的多聚蛋白pp220和pp62組裝成異常的拉鏈樣結構，該結構由細長的膜結合蛋白組成。此外，pp220和pp62在COS細胞中共表達時，該兩種蛋白相互作用形成拉鏈樣結構，pp220的表達則為pp62的加工奠定了基礎［19]。因此，pp220和pp62水解為p150、p37、p14、p34、p35和p15蛋白成為病毒顆粒成熟的重要標志［23-24]，當pp220和pp62蛋白的水解受阻，組裝的病毒顆粒則缺少內核芯殼，或者組裝的病毒粒子不具有感染性［21-22]。

1.2 pp220和pp62蛋白水解產物

p37蛋白作為病毒內核芯殼的組分之一，是ASFV編碼的第一個細胞核-細胞質骨架穿梭蛋白，具有輸出和輸入活性［25]。p37是pp220的水解產物，并與SUMO-1家族的蛋白酶具有較高的氨基酸序列相似性。通過對ASFV感染的細胞中p37進行定位，發現在病毒感染的早期，p37存在于細胞核的多個不同區域；而在感染后期，其僅存在于細胞質［26]。有學者研究發現，p37蛋白N-末端和C-末端區域主動從細胞核轉運到細胞質，CRM1依賴性和CRM1非依賴性核轉運途徑介導p37核酸轉運途徑，p37蛋白中疏水性氨基酸對上述3種核轉運信號功能至關重要［27]。這些研究表明，p37核酸轉運途徑對整個ASFV復制周期起著重要作用［26]。

p34蛋白作為重要的結構蛋白，有學者研究發現，p34蛋白受胰蛋白酶的保護。同時，可從胞質溶膠和膜組分中回收被錯誤加工的p34蛋白［21]。p34和p150蛋白膜相關組分可組裝成病毒基質結構，大多數被錯誤加工的p150亦可從胞質溶膠之中回收，而p150的正確加工產物則被選擇性地聚集到內囊膜［23]。p35和p15蛋白主要存在于內核芯殼，其基質樣結構域位于含有DNA的類核和內囊膜之間，p35、p15蛋白和pp220水解產物在病毒粒子中以等分子量形式存在［18]。p14蛋白作為pp220的又一水解產物，參與抑制病毒DNA的復制，屬于早期病毒蛋白。采用免疫熒光技術發現，該蛋白存在于被ASFV感染細胞的胞質膜，p14特異性抗體介導ASFV感染細胞的補體依賴性細胞溶解和抗體依賴性細胞毒性［28]。

有學者采用蛋白質組學分析技術對pp220和pp62蛋白成熟產物進行預測，發現兩種從未檢測到的小蛋白p8和p5［16]。p8蛋白是含有67個氨基酸序列的成熟蛋白，該蛋白由病毒pS273R蛋白酶在pp62蛋白Gly-Gly-X（任意）序列處切割水解而成。在第158-159氨基酸位點（GGG位點），pp62蛋白被水解切割為p15蛋白和中間前體（pp46蛋白）；在第463-464氨基酸位點（GGR位點），進一步水解切割為成熟的p35和p8蛋白。p35和p15蛋白易被其特異性抗體檢測，但是通過免疫印跡技術發現，pp46中間前體蛋白誘導產生的p8抗體不能檢測p8蛋白，其原理尚不清楚［16，29-30]。p5蛋白為含有43個氨基酸序列的成熟蛋白，在pp220蛋白第44-45氨基酸位點（GGG位點）水解切割而成。p5蛋白與p8蛋白相比，其蛋白小，免疫原性低，可快速降解，不易被檢測［16，29-30]。有學者采用質譜（MS）分析技術進一步證實了p5和p8蛋白是病毒顆粒的結構組分［16]。總之，pp220、pp62及其水解加工產物在病毒的組裝和感染過程中具有重要的功能。

2 內囊膜蛋白

2.1 p54蛋白

ASFV通過受體介導的胞吞機制進入靶細胞，利用囊膜和內吞泡膜的融合機制將病毒釋放到細胞漿。p54蛋白由E183L基因編碼，含有跨膜結構域和Gly-Gly-X氨基酸基序，以及多種ASFV結構蛋白的加工識別序列，位于病毒顆粒的內囊膜，是ASFV非常重要的抗原蛋白［31]。有學者制備了一種具有感染性的重組ASFV，確定感染細胞內病毒的運動軌跡和速度，從而將“病毒加工廠”的形成動態實現可視化［31]。采用轉染細胞瞬時表達p54蛋白，發現該蛋白主要存在于轉染細胞內質網膜。當p54蛋白合成受阻，則病毒粒子的形成受抑制。這表明，在病毒蛋白經內質網膜轉化成病毒包膜時，p54蛋白扮演重要角色［32]。在ASFV感染的早期階段，p54可以激活caspase 3，進而誘導細胞凋亡，這是首次報道ASFV蛋白可以誘導細胞凋亡［33]。

在病毒感染期間，p54直接結合到動力蛋白C-末端的輕鏈8（LC8），進而與微管動力蛋白相互作用［34]。采用核磁共振（NMR）技術發現，p54和突觸后支架蛋白是動力蛋白輕鏈（DYNLL1）的兩個靶標，這兩種蛋白與DYNLL1直接相互作用，同時谷氨酰胺對其結合起著重要作用，并且這些蛋白序列都含有GIQVD和KXTQT基序［35-36]。采用減毒毒株免疫接種動物，發現p54在誘導特異性抗體中起重要作用，p54抗體可以抑制ASFV的吸附［31，44]。因此，在桿狀病毒和大腸桿菌系統中表達的p54常被用于ASFV的血清學診斷［37-38]。曹琛福等［39]采用單克隆抗體對p54蛋白抗原表位進行鑒定，發現第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點。p54和p30蛋白作為與ASFV侵入宿主細胞密切相關的結構蛋白，其在病毒感染過程中具有相似的作用。與此同時，p54和p30作為抗原蛋白，可聯合用于ASFV酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法的研發，提高檢測方法的靈敏度［38-40]。

2.2 pE248R蛋白及其他內囊膜蛋白

pE248R蛋白是由E248R基因編碼的ASFV晚期結構蛋白，是重要的內囊膜蛋白，參與蛋白分子中二硫鍵的形成。在病毒感染過程中，該蛋白被酰基化處理，并與病毒粒子內囊膜相連［41]。有學者發現，pE248R蛋白的缺失不影響病毒的吸附和內化，但抑制病毒粒子在宿主細胞中復制，以及病毒基因的早期和晚期表達。因此，pE248R蛋白缺陷的誘導型重組ASFV內囊膜與內體膜不發生融合作用，抑制其向細胞質核心區域轉運［42]。pE248R和pE199L蛋白與痘病毒侵入/融合復合體具有很高的序列相似性，這表明該蛋白與ASFV融合機制有著密切聯系［42-43]。采用免疫電子顯微鏡發現，pE248R、p17、p12和pH108R蛋白位于病毒內囊膜前體和“病毒加工廠”內二十面體顆粒，而非細胞表面。p17和pE183L蛋白是病毒粒子組裝必需蛋白，而pE248R、p12和pE199L蛋白則與病毒侵入密切相關［20，41，44-45]。總之，在 ASFV 侵入宿主細胞后，pE248R蛋白對病毒基因的表達起重要作用。

p17蛋白作為ASFV重要的內囊膜蛋白，是病毒內囊膜上的跨膜蛋白，該蛋白可促進病毒膜前體進一步組裝為二十面體中間體，以及增強病毒活力。當p17表達受阻，將抑制pp220和pp62蛋白的水解［45]。p12蛋白作為又一內囊膜蛋白，由O61R基因編碼，參與病毒吸附，但是其吸附作用機制仍需進一步研究［46]。p22蛋白由KP177L基因編碼，位于病毒顆粒外部，可被非離子去污劑從病毒顆粒表面上溶解處理。有學者采用冷凍切片免疫金標記技術，確定p22蛋白的亞病毒定位［47]。J5R蛋白，又名pH108R蛋白，由H108R基因編碼，111個氨基酸組成，屬于ASFV感染晚期表達蛋白［44]。該蛋白N-末端含有跨膜結構域，參與免疫應答反應，在病毒復制和形態發生等方面起重要作用［48]。

表1 ASFV結構蛋白的作用

3 衣殼蛋白

3.1 p72蛋白

p72蛋白由B646L（VP72）基因編碼，是ASFV主要衣殼蛋白，是病毒二十面體衣殼的主要成分，具有高度抗原性和免疫原性。在病毒感染的晚期階段，p72與其他相關蛋白的表達，以及形成病毒衣殼都緊密相關［16]。在病毒顆粒形成初期，p72在細胞質中富集，并與內質網膜結合，在內質網膜凸出的表面上形成病毒顆粒衣殼，在凹進的表面上形成內核芯殼［16，49]。p72參與ASFV的吸附和侵入過程，該蛋白的表達常作為病毒復制的標志［49-51]。p72抗體可阻斷病毒與巨噬細胞的結合，但是其在抗體介導的免疫保護中不起決定性作用，這或許是目前尚無有效ASF疫苗的重要原因之一［40]。有學者采用針對p72和A151R基因的小干擾RNA（siRNA）技術來控制ASFV的體外復制，研究結果發現，靶向基因p72的siRNA可以降低病毒的復制，以及信使RNA（mRNA）水平［52]。將來自不同地區的ASFV毒株p72編碼基因序列進行分析發現，p72基因在不同分離株中具有高度的保守性［53]。這表明，p72蛋白有較穩定的抗原性，為ASFV抗原研究提供了良好的靶蛋白［54-57]。有學者研究發現p72蛋白N端第11-18位、第26-48位、第73-82位、第136-150位、第159-174位、第181-189位、第191-210位、第247-276位、第279-295位、第313-323位和第382-392位氨基酸為p72蛋白的抗原位點［58]。

3.2 其他衣殼蛋白

p14.5蛋白，又稱pE120R蛋白，是病毒衣殼蛋白之一，是DNA結合蛋白，參與抑制病毒DNA復制，是病毒粒子從“病毒加工廠”轉移到胞質膜過程中的必需蛋白質。該蛋白由E120R基因編碼，參與病毒粒子的胞內運輸，其在病毒內核芯殼和衣殼的形成過程中起著重要作用［59]。有學者采用二維凝膠電泳（2DE）和MS技術發現，在病毒感染期間，p14.5蛋白N-末端丙氨酸（Ala）殘基被乙酰化處理。與正常表達條件下比較，當pE120R蛋白表達受阻時，胞內病毒滴度未受影響，但胞外病毒滴度比對照組低100倍［59-60]。p49蛋白由B438L基因編碼，屬于ASFV感染晚期表達的病毒衣殼蛋白，是形成具有感染性病毒粒子的必需結構蛋白，由438個氨基酸組成，存在于“病毒加工廠”［61]。該蛋白缺乏時，組裝的病毒粒子不呈二十面體對稱結構，而呈異常的管狀結構。在病毒感染期間，pB438L蛋白與膜結合，表現為完整的膜蛋白［61-62]。

4 外囊膜蛋白

CD2v蛋白，又稱pEP402R蛋白，是一種糖蛋白，類似于T淋巴細胞表面的黏附受體CD2，由信號肽、跨膜域以及147個氨基酸的胞質尾組成。在ASFV感染期間，調節性反式高爾基體網絡（TGN）蛋白復合物AP-1作為CD2v蛋白的靶標。CD2v蛋白主要在T細胞和NK細胞上表達，采用共聚焦顯微技術發現，大部分表達的CD2v蛋白主要位于細胞質“病毒加工廠”周圍區域，而非細胞表面［63]。在缺乏細胞外配體時，絕大多數的CD2v蛋白主要位于細胞核周膜腔區域［64]。在感染后期，紅細胞吸附現象表明感染細胞中CD2v蛋白得到表達。在內質網或高爾基體中，CD2v蛋白可被切割成N-末端糖基化和C-末端非糖基化兩種形式。與此同時，在感染細胞中，這兩種切割形式可與CD2v完整蛋白同時存在［63]。CD2v蛋白參與細胞間黏附、毒力增強和免疫應答調節過程，對ASFV的組織趨向性、免疫逃避等一系列致病機理起著重要作用［65]。CD2v蛋白可破壞淋巴細胞功能，并且該蛋白的表達與ASFV在家豬之間的傳播有著密切聯系。有學者采用酵母雙雜交系統發現，CD2v蛋白的細胞質尾部可與細胞質接頭蛋白SH3P7相互作用，而SH3P7蛋白質參與多種細胞功能調節，如囊泡轉運和信號轉導［64]。有學者提出，將CD2v蛋白的細胞質區域作為新的遺傳標記，這一特性可用于分析來自不同區域的ASFV毒株，并追蹤病毒的傳播軌跡，最終建立基于蛋白質細胞外部分的全球毒株血清學分類體系［66-67]，研究ASFV毒株在自然界中的多樣性，并為疫苗研發奠定堅實的基礎［66-68]。p12蛋白C-末端區域富含半胱氨酸的結構域，參與病毒的吸附，在病毒感染的晚期，由O61R基因表達，有學者通過免疫電子顯微鏡發現，該蛋白位于病毒粒子層，細胞表面的膜蛋白是ASFV的受體。在機體外，p12蛋白可阻斷ASFV侵入宿主細胞，但p12蛋白抗體被動接種機體內，其不能中和ASFV，進而達到被動保護機體的作用［69]。

5 總結與展望

ASF作為一種急性、烈性、出血性的豬傳染性疫病，給疫情發生國家（地區）的養豬業帶來嚴重的經濟損失。我國作為對外貿易強國和養豬業大國，一旦ASF在我國完全定殖，將會給我國的養豬業帶來嚴重損失，ASF防控形勢不容樂觀［70-71]。ASFV基因型較多，種類龐大，免疫逃逸機制復雜多樣。ASFV編碼蛋白的數量眾多，其中結構蛋白作為病毒顆粒的主要組分，參與病毒的吸附、進入和復制等感染階段。雖然相關蛋白的研究不斷得到深入，但仍有大量編碼蛋白的功能，以及與宿主細胞的作用機制尚不清楚，這系列問題必將成為ASFV研究的熱點。國內學者先后對ASFV的致病機理、分子流行病學、診斷方法、疫苗研究等方面進行了綜述［72-75]，對ASFV的致病機制有了一定的認識，但仍有不足之處。因此，本文通過對參與ASFV感染的結構蛋白，以及這些蛋白和宿主細胞之間相互作用的機制進行綜述，進一步闡釋ASFV結構蛋白在感染過程中的作用，為我國的ASF防控提供理論參考。