灘羊微衛星標記多態性及與體尺性狀關聯分析

李標 張瑞瑩 王小琪 張存芳 段子淵

（1. 寧夏大學農學院，銀川 750021；2. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所資源研究中心，北京 100101；3. 中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008）

灘羊是蒙古羊經游牧遷徙至寧夏境內，于黃河兩岸草灘世代繁育形成的優良裘皮與肉用羊［1]，是我國特有的地方綿羊品種，屬國家重點保護羊種之一?，F主要分布于寧夏以及毗鄰的甘肅、內蒙古、陜西等部分地區［2]。灘羊肉富含人體所需的脂肪酸、維生素、氨基酸等營養成分以及鐵、磷、鉀等礦物質［3-4]，風味氨基酸含量高，肉質細嫩鮮美。與我國地方羊品種類似，灘羊存在生長發育緩慢、繁殖率低（1年平均胎產羔率102%）、尾脂和內脂沉積較多等缺點，導致養殖經濟效益較低［1，3，5]。因此，需要利用各類先進的技術手段保持灘羊的特色性狀，同時克服其自身缺點。開展對基礎母羊群體的深入了解則是開展有計劃改良的前提。

在眾多對群體遺傳結構進行分析的技術手段中，廣布于基因組的微衛星標記（Microsatellite 或Simple sequence repeats，SSR）能提供豐富的多態位點，易于檢測、分析方便［6]，是快速了解群體遺傳背景的有效而經濟的手段［7-9]。例如，陳仁金等通過10個高多態性微衛星位點分析寧夏白色灘羊與黑色灘羊群體，發現它們之間存在一定的遺傳分化［10]，但湯曉良通過10個微衛星位點分析灘羊群體內部遺傳變異和親緣關系時卻發現寧夏白色和黑色灘羊群體間分化程度較低［11]。究其原因主要與取樣時群體的狀態和樣本量、使用位點的不統一及其位點信息的多寡有關。閆路娜等［12]在種群微衛星DNA分析中發現微衛星分析群體所需樣本量最低應大于30才不會對各種遺傳多樣性度量指標有影響；李鷗等［13]研究認為在分析群體遺傳多樣性時樣本含量應大于40，較高多態性的微衛星位點數量應大于25。顯然，針對同一品種的基因組信息使用一套數量較多和多態信息豐富的標記位點將是比較的前提和基礎。

此外，微衛星標記還用來檢測與性狀間的關聯而作為分離功能基因的手段之一，被廣泛用于構建遺傳連鎖圖譜、定位數量性狀基因座、評估遺傳多樣性、反應品種間的遺傳關系等。Pei等［14]從71個微衛星標記中篩選出17個可對牦牛進行親子鑒定；孫業良等［15]分析微衛星標記與中國美利奴羊肉用品系體重的相關關系時，發現緊密連鎖的基因座OARHH35和BMS648與體重間存在顯著差異（P＜0.05），找到一個影響體重的數量性狀座位（Quantitative trait locus，QTL），同時檢測出6個微衛星位點與體重呈正相關。

本研究旨使用篩選的一套適用于灘羊檢測的29個微衛星標記位點，檢測了寧夏灘羊核心產區部分基礎母羊的群體遺傳多樣性，分析了上述微衛星位點與灘羊8項體尺指標間的關聯性，旨為灘羊的種質資源保護、群體遺傳改良的輔助育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為從寧夏回族自治區鹽池縣灘羊種羊場群體中隨機選擇年齡在1-3歲范圍的灘羊母羊96只。主要擴增試劑為南京諾維贊生物科技公司生產的2×Taq Master Mix預混酶，熒光引物于北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物篩選 通過文獻查閱和搜尋綿羊相關基因組數據庫匯集可用的綿羊微衛星標記位點，以20只左右隨機選取的小群體灘羊DNA為模版，進行PCR擴增篩選。反應體系為15 μL，使用 2×Taq Master Mix預混酶，采用 TP-M13-SSR 技術［16]，通過巢式PCR擴增反應添加熒光標記，反應條件為：94℃預變性3 min，15個循環的PCR擴增（94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min），之后25個循環的熒光標記PCR（94℃變性40 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min）最后72℃延伸10 min，反應完成后4℃保存。對 PCR結果進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增條帶狀態和多態性確定是否入選。

1.2.2 體尺測量、組織樣本采集與DNA提取 逐一測量每個個體的體重、體尺性狀（體斜長、體高、薦高、胸圍、胸深、胸寬、腰角寬和管圍），同時剪取其耳組織樣品，置無水乙醇中，存放于-20℃冰箱。使用酚-氯仿法提取灘羊每個個體的基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測純度及濃度，原液置于-20℃冰箱內長期保存，滅菌去離子水稀釋為20 ng/μL工作液，4℃冰箱保存備用。

1.2.3 SSR位點擴增與數據分析 對96個灘羊個體DNA樣品按照1.2.1步驟進行PCR擴增，電泳檢測，帶型合格的樣品稀釋純化后，送北京天一輝遠生物科技有限公司用ABI3730 DNA Analyzer分析獲取電泳熒光數據。之后用GeneMarker V2.2.0［17]軟件讀取，使用基于Excel的MStools［18]進行數據格式轉換及統計，并計算多態信息含量（Polymorphism information content，PIC）。分別用 GENEPOP 1.32［19]分析計算上述SSR標記在群體中的期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）；用 GenAlex 6.5［20]軟件估算群體的遺傳距離并生成主坐標分析圖；STRUCTURE 2.3［21]軟件和在線軟件Structure Harvester（http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/#）進行群體結構分析；TASSEL 5.0［21]軟件進行性狀的關聯分析。

2 結果

2.1 灘羊體重、體尺測定

測定的96只灘羊基礎母羊的體重與體尺數據，見表1。

2.2 微衛星標記多態性及群體遺傳多樣性檢測

利用TP-M13-SSR系統和瓊脂糖電泳檢測，獲得29個條帶清晰明亮、具有較好多態性的SSR標記，可用于灘羊群體遺傳分析。用此套標記檢測96個灘羊基礎母羊的群體遺傳背景，結果（表2）顯示，該群體的等位基因數為4-22，平均等位基因數9.5；有效等位基因數1.7-9.6，平均有效等位基因數4.5；期望雜合度0.41-0.90，平均期望雜合度0.72；觀測雜合度為0.22-0.93，平均觀測雜合度0.64；多態信息含量0.38-0.89，平均多態信息含量0.69，屬于多樣性較高的群體。

2.3 灘羊群體遺傳結構檢測

用遺傳距離矩陣進行96個個體的主坐標分析（PCoA）結果見圖1。圖中顯示該基礎母羊群個體間遺傳距離分布較為均勻，不存在明顯的分化。利用STRUCTURE軟件基于群體基因型分布頻率進行的群體結構估算顯示，本實驗所抽樣的群體內遺傳背景來源豐富，具有一定的多樣性，并根據在線軟件Structure Harvester計算出：當K=3時，ΔK值最大，灘羊基礎母羊群體結構最佳（圖1和圖2）。

2.4 微衛星標記與體尺的關聯

灘羊微衛星標記與基礎母羊體尺性狀的關聯分析結果見表3。結果顯示，MAF33與體高、胸深存在顯著關聯（P＜0.05）；標記BMS1788與薦高、胸圍顯著或極顯著關聯（P＜0.05，或P＜0.01）；而管圍與5個標記MAF33、BMS500、BL41、BMS835和BOVILS56均極顯著關聯（P＜0.01）。

3 討論

本研究對96只1-3歲成年灘羊種羊場母羊群體的體重和體尺進行了測定，成年母羊的體重為49.20±5.27 kg，與《中國羊品種志》中灘羊的測定數據［22]和吉帥［23]2013年對12月齡成年母羊測定的數據（41.58±4.11 kg）相比，體重較大?！吨袊蚱贩N志》數據顯示，母灘羊的成年體重一般春季為35 kg，秋季為45 kg，本次測定的體重數據呈現增加態勢，一方面說明隨著寧夏禁牧舍飼措施的實施，舍飼狀態下羊只體重比放牧狀態有所提高；另一方面也說明持續實施的保種選育措施在體重性狀的改良上呈現出良好的選擇效應，這一結論也得到錢文熙等和周靜靜等［24-26]研究結果的支持。

Barker等［27]的研究表明微衛星位點最少應該有四個等位基因才可進一步利用遺傳參數進行多樣性評估，本研究所篩選的29個灘羊微衛星位點均具有超過4個等位基因，平均有效等位基因數4.41。從衡量基因片段多態性的多態信息含量（PIC）來看，若微衛星位點的PIC＞0.5，該微衛星位點為高度多態性位點；若0.25＜PIC＜0.5，則該位點是中度多態性；若PIC＜0.25，則屬于低度多態性位點［28]。本研究篩選出的位點中，除DU264615、HUJ625、BM2504屬中度多態性位點外，其他26個微衛星位點均是高度多態性位點。說明該29個灘羊微衛星位點適宜用于灘羊群體的遺傳多樣性和群體遺傳結構的正確評估以及生產性狀的相關性分析。

圖1 灘羊基礎母羊遺傳距離的主坐標（PCoA）分析結果

圖2 灘羊基礎母群群體ΔK值折線結果

從對96個抽樣個體的群體檢測結果來看，29個位點的等位基因數與有效等位基因數相差較大，群體的平均多態信息含量值為0.691 8，說明該群體遺傳多樣性較為豐富。從廣泛用于度量群體遺傳變異的參數雜合度來看，若群體雜合度大于0.5，說明該群體未受到較高強度的選擇，有豐富的多樣性；反之，小于0.5，說明該群體遺傳多樣性較低［29]。本抽樣群體的平均期望雜合度為0.722 4，平均觀測雜合度0.643 4，表明該灘羊群體的遺傳變異豐富。湯曉良［11]利用10個微衛星標記分析寧夏灘羊群體時測定的平均期望雜合度是0.801 4-0.814 2，而平均觀測雜合度是0.269 3-0.300 0，兩者差值相差較大，可能由于各個種羊場配種種公羊較少或為獲得某一性狀而近交導致，他依據當時灘羊繁育面臨的困難局面，由此得出灘羊品質嚴重退化的結論，但這也可能與使用的微衛星位點數量不足和多態程度不高有關。2011年，婁淵根［30]用10個微衛星標記測定的寧夏灘羊平均期望雜合度是0.671 1，平均觀測雜合度0.492 5。本研究測定的相應值高于湯、婁的結果，無論從使用的微衛星數量還是從各位點的多態程度來看，應更具客觀性。

圖3 灘羊基礎母羊群體STRUCTURE結果圖

表3 微衛星標記與灘羊群體體尺性狀關聯分析矯正后的P值

通常，由于飼養環境長期相對隔離，對于小群體羊場或農戶則會造成群體內個體間的遺傳距離過小，甚至群體的后代可能出自同一個家系而長期近交造成種群衰退［31]。據統計，2016年寧夏鹽池縣建成飼養量大于1 000只的規?；B殖場317個，大型養殖園區23個［32]，區內每年以補貼機制低價調配供給各養殖場種公羊，避免了各羊場母羊群體內家系狹窄而出現的近交現象。本研究基于個體間遺傳距離得出的主坐標分析圖顯示，灘羊基礎母羊群體內不存在明顯的遺傳分化；從推斷群體遺傳結構的STRUCTURE直觀分析結果來看，當K = 3時，ΔK最大，群體均一但遺傳背景豐富。說明該灘羊群體既保持了豐富的遺傳變異，又在很大程度上保持了品種的同質性，不會產生群體性分化而可能導致新的基因群出現［33]。

對家畜測量的體尺是生長性狀的外在表現。本次用微衛星進行的性狀關聯分析共發現6個位點MAF33、BMS1788、BMS500、BL41、BMS835 和BOVILS56與生長性狀間有顯著或極顯著關聯。通過與數據庫對比發現，這些關聯位點中有些在其他綿羊品種或山羊中也存在與經濟性狀的關聯，如BMS1788 與新疆細絨山羊的絨毛細度、長度和產量相關［34]；BMS835與中國美利奴羊羊毛的長度及細度相關［35]；而MAF33 標記與眼肌面積、凈肉重相關聯［36]。說明這些標記可能與控制性狀的 QTL 或主基因連鎖［12]。另外，MB116、MB076和BM7109的期望雜合度分別是0.664 1、0.720 0、0.753 2，觀測雜合度分別是0.276 6、0.234 0、0.215 9，期望雜合度與觀測雜合度相差較大，說明這些位點的等位基因在群體內的分布并不均勻，這可能與位點受到選擇作用相關，提示其與某些性狀的關聯性。本研究中，與標記位點的關聯中既有一個標記同幾個性狀相關聯，也有幾個標記同一個性狀相關聯的，看似是位點存在一因多效或多因一效的現象［37]。顯然，無論是連鎖還是多效關聯，均應是位點所在的基因片段與實際控制性狀的基因相關，或者控制該性狀的基因本身就位于該區域，直接或參與了該性狀呈現表型的生理過程，值得后期在大規?；蚪M關聯分析和功能基因的分離中予以重點關注。

4 結論

本研究中，微衛星位點DU264615、HUJ625和BM2504是中度多態性位點，其他26個微衛星位點是高度多態性位點，而位點MB116、MB076和BM7109 呈現出觀測雜合度顯著偏離期望雜合度的現象，說明這幾個位點可能與某些性狀相關聯；位點 MAF33、BMS1788、BMS500、BL41、BMS835 和BOVILS56與生長性狀間有顯著或極顯著關聯，值得進一步研究。綜合多個指標的群體遺傳背景分析來看，本試驗所抽樣的灘羊群體其遺傳變異豐富，存在較好的多樣性，可供該品種內選擇的范圍較廣；保種選育加環境改善導致基礎母羊體重顯著增大的實踐也表明，對該灘羊群體實施品種內提純復壯的遺傳改良前景良好。所以，建立完善的譜系檔案和交配記錄，定期開展群體遺傳距離和遺傳結構的監測有利于監控種群在遺傳水平上的健康情況。