小分子前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

周劍 孫菲 方志鍇 江紅

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

巴弗洛霉素（Bafliomycins）是一類化學結構上極為特殊的多烯16元環內脂類抗生素，其大部分衍生物的側鏈結構中都含有一個六元環的半縮醛結構［1-2]。其中巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一種空泡H+-ATP酶（V-ATPase）的特異性抑制劑，能夠抑制自噬體和溶酶體結合而抑制自噬［3]。V-ATPase廣泛分布于真核生物的液泡，溶酶體，反式高爾基體，分泌顆粒，核內體等細胞內膜系統中，根據細胞器官的微小酸性差別，各自發揮獨立機能，是一種新的藥物靶點［4-5]。另外，巴弗洛霉素類化合物還具有抗細菌［6]、抗真菌［7]、殺蟲［8]、除草［9]、抗腫瘤［10]以及免疫抑制等多種生物活性［11]。

在大環內酯類抗生素的生物合成中，低級脂肪酸、氨基酸、小分子有機酸/醇等可以作為前體單元構成內酯環，但部分前體物不易被菌體合成，因而成為大環內酯類抗生素生物合成的限制性因素［12]。安絲菌素發酵過程中添加前體物纈氨酸、異丁醇等均能有效提高主組分安絲菌素P-3含量［13-14]；紅霉素發酵過程中添加甘氨酸、植物油等也可以促進紅霉素產量，使主組分紅霉素A比例提高，降低紅霉素C含量［14，16]；那他霉素生產過程中添加0.6%的丙酸鈉，可以使發酵效價提高1.8倍［17]。由此可見，在發酵培養基中加入適量的前體物質，通過發酵代謝調控，就有可能縮短其生物合成周期，提高大環內酯類抗生素發酵產量。根據巴弗洛霉素的化學結構特點和生物合成途徑［18-19]，本文選取乙酸鈉、丙酸鈉、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異丁醇、異丁酸等考察外源性前體物對巴弗洛霉素生物合成的影響，以期通過前體物質的添加提高巴弗洛霉素A1的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 菌種鏈霉菌FIM-B0711由本研究室篩選保藏。

1.1.2 培養基 斜面培養基：ISP2。分離平板培養基：ISP2。種子培養基：麥芽浸粉 2.0%；蛋白胨 2.0%；CaCO31.0%。（pH為7.2）。發酵培養基：可溶性淀粉4.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉2.0%、玉米漿1.5%、碳酸鈣0.2%（pH為7.0）

1.2 方法

1.2.1 培養方法 斜面28℃培養10-12 d待孢子生長成熟以后，刮取新鮮孢子接于種子培養基，置于28℃培養、搖床轉速為220 r/min，培養48 h左右；按5%的接種量接種到發酵培養基，后置于28℃、搖床轉速220 r/min，振蕩培養120 h。

1.2.2 巴弗洛霉素A1的高效液相色譜（HPLC）檢測法 樣品處理：發酵液加入2倍體積乙醇，混勻、超聲20 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為待測液。

HPLC分析方法：Agilent 1200 series高效液相色譜儀，Syncronis C18 分析柱（4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm），流動相為甲醇：水=85∶15，進樣量為10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫：40℃。根據樣品峰面積/標準液峰面積×標準液濃度計算產量。

1.2.3 菌絲濃度測定 采用PMV（Packed Mass Volume）法，取發酵液10 mL于10 mL刻度試管中，于5 000 r/min離心 15 min，記錄沉淀物毫升數。依下列計算菌絲濃度：菌絲濃度=（沉淀物毫升數/10）×100%。

1.2.4 總糖的測定 斐林試劑測定法［20]

1.2.5 氨基氮的測定 甲醛法［21]

1.2.6 不同前體對巴弗洛霉素A1生物合成的影響 在發酵培養24 h后分別向發酵培養基中加入0.1%的醋酸鈉、丙酸鈉、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異丁醇、異丁酸，繼續培養，在發酵120 h時測定發酵液中巴弗洛霉素A1產量及菌絲濃度，確定最佳前體物質。以無添加前體物的基礎發酵培養基為對照。

1.2.7 前體添加濃度對巴弗洛霉素A1生物合成的影響 在發酵培養24 h后分別向發酵培養基中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的最佳前體物，發酵結束后測定巴弗洛霉素A1產量、菌絲濃度及pH值，確定最佳添加濃度。以無添加前體物的基礎發酵培養基為對照。

1.2.8 前體加入時間的考察 分別在發酵培養的第0、12、24、36、48、60、72 h時，向發酵培養基中加入最佳前體，發酵結束后測定巴弗洛霉素A1產量、菌絲濃度及pH值，確定最佳加入時間，以無添加前體物的基礎發酵培養基為對照。

1.2.9 發酵罐上補料實驗 新鮮斜面接入裝量為80 mL/500 mL搖瓶種子培養基中，28℃，220 r/min培養48 h后合并種子液，按5.0%左右的接種量移種到20 L發酵罐中培養。在發酵培養過程中，通過攪拌及通氣量控制發酵液DO值在30%-60%之間，一般通氣為1∶0.8-1.5 vvm，攪拌轉速在200-500 r/min之間。在發酵進行到36 h時一次性加入發酵液體積0.2%的纈氨酸溶液。

2 結果

2.1 不同前體對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

圖1顯示，添加0.1%纈氨酸可促進菌體生長及有效提高巴弗洛霉素A1發酵產量，達217.6 mg/mL，比對照組提高約36.0%；添加0.1%甲硫氨酸對菌體生長影響不大，但可提高巴弗洛霉素A1發酵產量，達到184.2 mg/mL，比對照組提高了約15.0%；添加0.1%的乙酸鈉和丙酸鈉對巴弗洛霉素A1產量和生物量沒有明顯影響；而添加0.1%的異丁醇和異丁酸可以提高巴弗洛霉素效價，但效果不明顯且會抑制菌體生長；而亮氨酸、異亮氨酸可以促進菌體生長，但會降低巴弗洛霉素A1的產量；由此可見纈氨酸為最佳的外源前體物，后續實驗選擇纈氨酸進行最適添加量及添加時間的研究。

圖1 不同前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

2.2 纈氨酸添加濃度對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

圖2顯示，在發酵24 h左右往培養基中添加纈氨酸濃度為0-0.1%時，菌體濃度持續增加，巴弗洛霉素效價也增加；當纈氨酸濃度達到0.2%時，菌體濃度開始下降，但此時巴弗洛霉素A1效價達到最高；繼續加大氨基酸添加量后菌體濃度持續下降，巴弗洛霉素A1效價也跟著下降。有可能是因為高濃度纈氨酸對菌體產生抑制作用，導致生物量的減少進而降低發酵效價。因此，確定前體纈氨酸的最佳添加量為0.2%，此條件下巴弗洛霉素A1產量為264.5 mg/mL，比對照提高了65.3%。

2.3 纈氨酸添加時間的選擇

圖3顯示，在第36 h添加纈氨酸時，巴弗洛霉素A1產量及菌絲濃度均比對照組有所提高，此時添加纈氨酸效果最好，巴弗洛霉素A1產量高達285.5 mg/mL，比對照組提高了78.4%。

圖2 纈氨酸添加量對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

從圖3上生物量的變化可以看出，在培養0-24 h時加入纈氨酸，菌絲濃度逐漸增加，發酵效價也升高，可能是由于部分纈氨酸作為細胞生長的碳源而促進生長，另外纈氨酸也會誘導次級代謝的酶活從而提高效價；而第36 h是處在鏈霉菌FIM-B0711開始進入次級代謝產物巴弗洛霉素合成的階段，此時加入纈氨酸，大部分能作為次級代謝前體物質直接轉化為丙酰CoA合成巴弗洛霉素A1，因此發酵效價最高。

在培養48 h之后加入纈氨酸，巴弗洛霉素A1產量下降，而生物量反而有所上升，這可能是由于纈氨酸是初級代謝產物有可能引起菌體二次生長而改變生物合成進程從而降低發酵效價。所以最佳的前體物補料時機為在發酵培養36 h時加入0.2%的纈氨酸。

圖 3 纈氨酸添加時間對巴弗洛霉素A1生物合成的影響

2.4 發酵過程考察

在20 L發酵罐進行發酵試驗，在培養36 h左右，往發酵罐加入總量0.2%的纈氨酸溶液，對照組為不添加纈氨酸發酵罐。

由圖4可以看出，添加纈氨酸發酵時總糖消耗速率較快，說明纈氨酸可以提高菌體的代謝合成。氨基氮曲線的變化可以看到，沒有添加前體物的發酵過程，前36 h由于菌體細胞的生長和繁殖消耗了大量的氨基氮，導致氨基氮含量下降較快，同時伴隨著pH值的下降；之后氨基氮消耗緩慢，此時pH值有所回升；在發酵后期（發酵72 h后），氨基氮緩慢回升，而pH值也在升高，可能是由于發酵后期菌體開始衰老、自溶，釋放部分氨基氮。而在36 h時添加纈氨酸可以看到氨基氮在36-48 h恢復到較高水平，然后再下降，在60 h后又開始緩慢上升；這可能是由于添加氨基酸后促進菌體生長和代謝合成，隨著發酵的進行氨基酸被大量消耗而導致氨基氮減少，發酵后期產物大量合成，菌體開始自溶，氨基氮又緩慢回升。

圖4 發酵曲線對比

由于發酵過程控制發酵罐轉速以盡量保證菌體對氧的需求，所以兩種發酵方式的溶氧曲線變化基本一致。在發酵0-36 h隨著菌體的快速生長，DO值迅速下降到30%左右，此時提高轉速增加發酵液中氧氣含量，在發酵中后期菌體進入次級代謝合成期對氧的需求開始下降，此時可以適當降低轉速，以減少攪拌剪切力對菌絲體的損傷。

從菌絲濃度變化的曲線可以看出，巴弗洛霉素A1發酵過程中存在兩個階段（菌體生長期和產物合成期），發酵前期（0-36 h）菌體生長、繁殖較快，為菌體生長期，36-96 h菌絲濃度增長緩慢，此時開始大量合成次級代謝產物巴弗洛霉素A1；在發酵后期，96-120 h菌體細胞開始衰亡自溶，巴弗洛霉素A1累積速度變慢，發酵120 h時巴弗洛霉素A1產量達到峰值。在發酵36 h時添加纈氨酸可以明顯促進菌絲體生長和大大提高巴弗洛霉素A1的生物合成速率和產量，120 h是巴弗洛霉素A1產量達到282.5 mg/L。

3 討論

目前已有公開報道的巴弗洛霉素發酵產量都不高。魏剛等［11]報道從海洋放線菌Y12-26發酵獲得bafilomycin A1，效價極低。潘華奇等［22]報道卡伍爾鏈霉菌經發酵產生的bafilomycin B1和bafilomycin C1含量分別達23.45 mg/L 和6.603 mg/L。楊巍民等［23]報道在40 L海洋放線菌Y-0117發酵液中獲得 bafilomycin D 純 品 約 0117A（14.7 mg）。Werner等［6]報道從100 L灰色鏈霉菌的發酵液中分離獲得 bafliomycins A1 45 mg、A2 36 mg、C1 120 mg，Yu等［24]從鏈霉菌YIM56209的9.6 L發酵液中獲得bafliomycins C1 1.8mg。Carr等［25]從海洋放線菌發酵液中分離到bafilomycin F。Lee等［26]報道在發酵過程添加80 mmol/L 纈氨酸添加可以使 bafilomycin產量達到35 mg/L。由此可見已有報道巴弗洛霉素發酵產量均太低，生產成本高，不足以實現工業化應用。

巴弗洛霉素A1大環內酯核心由I型PKS系統組裝，其聚酮延伸前體物為甲基丙二酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲氧基丙二酰輔酶A等［27-28]。這些短鏈脂肪酸酰基CoA可以通過脂肪酸或支鏈氨基酸等物質代謝獲得［29]。因此在發酵培養過程中加入適量前體物質，通過代謝調控，可能縮短其生物合成周期，提高巴弗洛霉素的產量。但如果外源前體在發酵液中的殘留濃度過高，又會使生產菌中毒，而不利于產物的生物合成。因此，研究適當的前體添加策略對有些次級代謝產物的高產穩產有重要意義。

添加纈氨酸可以提高巴弗洛霉素產量的原因可能是纈氨酸在菌體內代謝可得異丁酸，其是巴弗洛霉素生物合成的起始單元［26]，外源性地增加巴弗洛霉素生物合成起始單元可以大大地促進其生物合成。而添加亮氨酸或異亮氨酸抑制會乙酰羧酸合成酶（受單個末端產物抑制），使得胞內合成的纈氨酸減少［30]，從而降低產量。

4 結論

本文研究表明，纈氨酸作為前體物對巴弗洛霉素A1生物合成的促進作用優于甲硫氨酸、異丁醇及異丁酸，是較適宜的前體。在發酵培養36 h時添加0.2%纈氨酸，巴弗洛霉素A1產量高達285.5 mg/L，比對照組提高了78.4%。且這一實驗在20 L發酵罐上得以實現，為下一步菌株選育及發酵放大實驗提高基礎數據。