銻脅迫對斑馬魚酶活性的影響研究

岳鑫 楊愛江，2，3 徐鵬 胡霞，2，3 朱桓毅 包欣

（1. 貴州大學，貴陽 550025；2. 貴州大學環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計研究院，貴陽 550025；3. 貴州大學科技園發(fā)展有限公司，貴陽 550025）

由于工業(yè)迅速發(fā)展，銻（Antimony，Sb）及其化合物受到越來越多的關(guān)注，并在環(huán)境中呈現(xiàn)高濃度水平［1-2]，尤其富礦區(qū)域分布集中且濃度較高［3]。銻作為一種新興的全球性環(huán)境污染物，對生物體存在慢性毒性和潛在致癌性的危險物質(zhì)，被美國環(huán)保署和歐洲多國列為優(yōu)先防治污染物，在巴塞爾公約中，銻被列為可越境遷移的環(huán)境染物之一［4]。中國是產(chǎn)銻大國，全球超過90%的銻來自中國［5]。礦井廢水及殘留物是銻最大的來源和濃度高的區(qū)域［6-7]。因此，伴隨著銻礦的開采、冶煉，大量的銻流入到空氣、水體及土壤中，通過呼吸，皮膚吸收及食物鏈進入人體，對人體的心臟、皮膚等器官造成傷害［8-9]。盧莎莎等［10]測定了都柳江干流和支流水體中的銻含量發(fā)現(xiàn)，都柳江部分水體中含銻量高達2 223 μg/L，反映出我國面臨嚴峻的銻污染狀況。

近年來，研究學者對銻的毒性試驗研究進行了報道。王安等［11]以小鼠為受體，發(fā)現(xiàn)銻引起小鼠肝損害的機理與其損傷肝線粒體的抗氧化能力，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。王凱［12]研究發(fā)現(xiàn)銻能夠?qū)︱球窘饘倭虻鞍桩a(chǎn)生誘導效應，且蚯蚓金屬硫蛋白含量與銻暴露濃度呈顯著正相關(guān)。Yang［13]研究表明三價銻對青蝦的半數(shù)致死濃度是1.962 6 mg/L。綜上研究表明銻對生物體都具有明顯的毒性效應。

為了研究銻脅迫下，生物體內(nèi)各類酶活性的變化，本研究選取斑馬魚為受體進行試驗，了解生物對銻脅迫的響應機制。斑馬魚與人的基因相似度高達87%［14]，是一種模式生物，其生長周期短、魚卵體外受精易收集、魚身通體透明［15]，被廣泛用于生態(tài)毒理學研究。近年來，銻對斑馬魚毒性的研究基本僅限于半數(shù)致死濃度及富集系數(shù)，而銻脅迫對斑馬魚的酶活性效應研究鮮有報道。過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxisome，POD）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）隸屬于生物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以消除多余自由基，維持體內(nèi)自由基在一個正常的水平內(nèi)，保護細胞［16-17]。Na+K+-ATPase酶既是酶又是載體，可以催化ATP水解，同時也是組成Na+-K+泵活性的主要成分［18]。神經(jīng)沖動的正常傳遞要靠乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）來維持［19]。乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）是在細胞內(nèi)催化乳酸氧化成丙酮酸的重要酶［20]。磷酸酶參與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運輸，還是生物體內(nèi)重要的解毒體系，在蛋白質(zhì)去磷酸化過程中也起著十分重要的作用［21]。根據(jù)其反應的pH環(huán)境分為酸性磷酸酶（Lactate dehydrogenase，ACP）和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）。因此，本研究以斑馬魚為受體做毒性試驗，研究不同影響因素下斑馬魚體內(nèi)CAT、POD、SOD、AchE、LDH、Na+K+-ATPase酶、ACP和AKP活性的變化，從而探討銻脅迫下斑馬魚體內(nèi)酶系統(tǒng)的應激反應及斑馬魚應對銻脅迫的響應機制。以期類比人體受銻脅迫時所產(chǎn)生的毒性效應及體內(nèi)酶系統(tǒng)的響應機制，了解銻對人體的毒害作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚 市售斑馬魚，體長3-4 cm，在實驗室條件（24 h曝氣，26℃，光暗周期為t（光）∶t（暗）=12 h∶12 h），用曝氣3 d的自來水馴養(yǎng)1個月。每日吸取糞便及殘余餌料，并置換1/2的水（曝氣3 d），每日喂食（水騷干）兩次，直至死亡率小于1%方可用于毒理實驗，實驗前24 h停止喂食。

1.1.2 器材 紫外分光光度計、冷凍離心機、冷凍勻漿機、水浴鍋、分析天平、容量瓶等。

1.1.3 試劑 過氧化氫酶測定試劑盒（可見光法）、總超氧化物歧化酶測試盒（羥胺法）、過氧化物酶測定試劑盒（比色法）、超微量Na+K+-ATP酶測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶測試盒、乳酸脫氫酶試劑盒（比色法）、酸性磷酸酶測定試劑盒（分光光度法）、堿性磷酸酶測定試劑盒（可見光比色法）、總蛋白測定試劑盒（考馬斯亮藍法）（所有試劑盒均購于南京建成生物工程研究所），酒石酸銻鉀、NaCl等。

1.2 方法

1.2.1 銻脅迫下斑馬魚酶活性的變化 用曝氣3 d的自來水和酒石酸銻鉀配制銻溶液（0、10、20、30和40，0 mg/L為對照組），準備5個10 L魚缸，分別加入不同濃度的銻溶液和20尾體長3-4 cm、禁食24 h的成年斑馬魚。定期（24、48、96和144 h）取出斑馬魚，用生理鹽水洗凈后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將斑馬魚樣品制備成組織勻漿，通過酶活試劑盒對斑馬魚勻漿液進行處理，再用紫外分光光度計測定其吸光度，CAT、POD、SOD、AchE、LDH、ATP、ACP和AKP活性的變化情況。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 本實驗所有數(shù)據(jù)均測了3組平行，全部取平均值，用Origin9.1進行圖片繪制，用SPSS 20進行顯著性分析等。

2 結(jié)果

2.1 Sb對斑馬魚抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

2.1.1 Sb對CAT活性的影響 圖1展示了銻對斑馬魚CAT活性的影響，培養(yǎng)時間為24 h時，與對照組

圖1 銻對斑馬魚CAT活力的影響

2.1.2 Sb對SOD活性的影響 圖2展示了銻對斑馬魚SOD活性的影響，從圖中看出，隨著銻脅迫時間增加，銻含量為20、30和40 mg/L時SOD活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；在24、48和144 h時，各濃度組SOD活性基本都小于對照組，在96 h時，各濃度組酶活性都大于對照組。

圖2 銻對斑馬魚SOD活力的影響

2.1.3 Sb對POD活性的影響 銻對斑馬魚POD活性的影響由圖3可見，在24和144 h時，各濃度組POD活性均低于對照組，在48 h時，除40 mg/L時POD活性低于對照組，其余濃度組POD活性均高于對照組；在96 h時，10和40 mg/L濃度組POD活性濃度相比，不同銻濃度都對CAT活性有顯著的抑制作用，銻濃度為10 mg/L時，在48、96和144 h時CAT活性均大于對照組，銻濃度為20 mg/L時，CAT活性隨時間的增加呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢。低于對照組，20和30 mg/L濃度組POD活性高于對照組。

圖3 銻對斑馬魚POD活力的影響

2.2 Sb對斑馬魚Na+K+-ATPase酶活性的影響

銻對斑馬魚Na+K+-ATPase酶活性的影響見圖4，由圖可知，在24 h時，不同濃度Sb脅迫下斑馬魚Na+K+-ATPase酶活性均低于對照組，隨時間增加，10和20 mg/L濃度組酶活性也顯著增加；30和40 mg/L濃度組在48和96 h酶活性都呈現(xiàn)降低趨勢，而后隨時間增加到144 h，酶活性升高。

圖4 銻對斑馬魚Na+K+-ATPase活力的影響

2.3 Sb對斑馬魚乙酰膽堿酶活性的影響

銻對斑馬魚AchE活性的影響見圖5，由圖可知，在24 h時，各個濃度組銻脅迫下的AchE活性均低于對照組，隨著時間增加，低濃度組（10 mg/L）對AchE活性呈誘導效應，高濃度組（30和40 mg/L）對酶活仍呈抑制作用。

圖5 銻對斑馬魚AchE活力的影響

2.4 Sb對斑馬魚乳酸脫氫酶活性的影響

銻對斑馬魚LDH活性的影響見圖6，由圖可知，在24 h時，各濃度組酶活性均低于對照組，在48和96 h時，低濃度組（10和20 mg/L）酶活性高于對照組，高濃度組（30和40 mg/L）酶活性低于對照組，LDH酶活性隨銻脅迫濃度增加整體呈現(xiàn)“鋸齒形”變化趨勢。

圖6 銻對斑馬魚LDH活力的影響

2.5 Sb對斑馬魚磷酸酶活性的影響

2.5.1 Sb對ACP活性的影響 Sb對斑馬魚ACP活性的影響見圖7，從圖中可知，隨著時間增加，其ACP活性呈“鋸齒形”變化趨勢，在24 h時，各濃度組ACP活性均低于對照組，低濃度時（10 mg/L），在48和96 h時的 ACP活性均高于對照組，而144 h時ACP活性則低于對照組。

圖7 銻對斑馬魚ACP活力的影響

2.5.2 Sb對AKP活性的影響 Sb對斑馬魚AKP活性的影響見圖8，從圖中可見，在24 h時，低濃度組（10和20 mg/L）酶活性低于對照組，高濃度組（30和40 mg/L）酶活性則高于對照組。在48 h時，各濃度組AKP酶活性均高于對照組，在96 h時，10、20和30 mg/L酶活性高于對照組，而40 mg/L酶活性則低于對照組。

圖8 銻對斑馬魚AKP活力的影響

3 討論

3.1 顯著性分析

利用Univariat模型，分別對8種酶活性隨時間增加和Sb濃度增加的變化情況進行顯著性分析。

結(jié)果由表1可知，除AKP活性隨時間增長一般顯著外，其他酶活性隨時間和Sb濃度變化均呈極顯著，表明酶活性對時間和Sb濃度變化敏感度較強，數(shù)據(jù)有一定的統(tǒng)計意義。

表1 銻濃度及時間對酶活性變化的顯著性分析

3.2 Sb對斑馬魚抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

生物體內(nèi)的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）是代謝過程中必不可少的產(chǎn)物，通常情況ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，而當生物處于重金屬脅迫、有機物污染等逆境中時，就會產(chǎn)生大量ROS，主要包括超氧陰離子過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH），少量的ROS能作為細胞信號因子［22]，參與激活機體的抗氧化信號通路［23]，但大量ROS堆積就會損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等大分子，損傷若不能及時修復就會導致機體發(fā)生氧化損傷［24]，也就是氧化應激反應。CAT、SOD和POD廣泛存在于真核生物的各類細胞中，是抗氧化酶系統(tǒng)中比較重要的3種酶［25]。

3.2.1 Sb對CAT活性的影響 CAT可以將H2O2還原成H2O，阻止其與O2反應生成·OH［25]。低濃度（10 mg/L）的銻對CAT活性有一定的促進作用，可能是因為斑馬魚在銻脅迫下產(chǎn)生大量ROS，迫使機體產(chǎn)生大量CAT來調(diào)節(jié)ROS正常濃度范圍，是斑馬魚對銻適應的一種表現(xiàn)，這與陳立偉［26]探究鎘對黃顙魚CAT的影響一致。隨著銻的濃度逐漸升高、脅迫時間逐漸增加，斑馬魚機體內(nèi)的平衡可能被打破，大量的ROS堆積導致CAT活性降低，這表明斑馬魚可能由適應銻變成了銻中毒，過量ROS可能會破壞蛋白質(zhì)、DNA等大分子，造成機體損傷。

3.3 Sb對斑馬魚Na+K+-ATPase酶活性的影響

Na+K+-ATPase酶與膜上磷脂的結(jié)合狀態(tài)能影響膜的功能，還參與物質(zhì)運輸、氧化磷酸化以及能量代謝等生理生化過程，對維持離子梯度具有重要的意義［31]。從本次研究結(jié)果來看，在短時間內(nèi)各濃度組Na+K+-ATPase酶活性均低于對照組，表明銻可以在短時間內(nèi)影響斑馬魚的Na+K+-ATPase酶活性，Na+K+-ATPase酶活性降低可能是因為銻離子進入斑馬魚體內(nèi)與其膜上的ATP酶結(jié)合，從而改變ATP酶的空間結(jié)構(gòu)，阻止其與底物的結(jié)合，最終抑制了酶活性［32]。進而影響斑馬魚物質(zhì)運輸、能量代謝等生理生化過程，隨時間增加出現(xiàn)的Na+K+-ATPase酶活性增高的情況，可能是因為斑馬魚自身的調(diào)節(jié)功能，對銻脅迫產(chǎn)生了一定的適應。

3.4 Sb對斑馬魚乙酰膽堿酶活性的影響

AchE廣泛存在于各種動物組織中，在神經(jīng)突觸間隙中，通過催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿來終止其對膽堿受體的興奮作用，維持神經(jīng)沖動的正常傳遞［19]，其活性升高則會抑制興奮地傳遞，活性降低則表現(xiàn)為過度興奮，無論其活性升高或者降低都會影響斑馬魚正常的生理生化功能［33]。由圖5可知，短時間（24 h）內(nèi)各濃度組的AchE活性均低于對照組，表現(xiàn)出短時間內(nèi)的毒物興奮作用［33]，隨脅迫時間的增加，低濃度組AchE活性有些許增加，銻對AchE活性的抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M作用，抑制了其興奮的傳導，但高濃度組的AchE活性隨時間增加一直保持在較低水平，表明斑馬魚機體一直處于過度興奮的狀態(tài)。孟昭宇等［34]通過實驗發(fā)現(xiàn)，三價砷和五價砷脅迫下鯉魚、草魚等乙酰膽堿酶活性隨砷濃度增加呈先降低后升高的趨勢，砷與銻同為第ⅤA族，化學性質(zhì)相似，對魚的作用機制也可能相似。

3.5 Sb對斑馬魚乳酸脫氫酶活性的影響

LDH是在細胞內(nèi)催化乳酸氧化成丙酮酸的重要酶，當機體各個組織器官病變或受到損傷時，其內(nèi)部的LDH就要發(fā)生變化［20，35]。實驗結(jié)果表明，短時間內(nèi)各濃度組LDH酶活性均低于對照組，該研究結(jié)果與陳立偉研究的鎘對黃顙魚LDH的影響一致［26]，隨著時間增加，低濃度組LDH酶活性有所上升，斑馬魚機體在銻脅迫下具有更強的催化乳酸生成丙酮酸的能力，這是斑馬魚對污染刺激產(chǎn)生適應性的一種表現(xiàn)，以增強LDH活性的方式增加機體的能量代謝，但高濃度組的LDH酶活性仍很低。

3.6 Sb對斑馬魚磷酸酶活性的影響

3.6.1 Sb對ACP活性的影響 ACP是溶酶體的標志酶之一，表明溶酶體和其他水解酶的存在，也表明細胞內(nèi)消化的進行［36]，而斑馬魚可以通過胞飲作用直接吸收蛋白質(zhì)顆粒然后進行細胞內(nèi)消化［37]，ACP還參與免疫調(diào)節(jié)、信號傳導等生命活動，在細胞損傷和修復過程中發(fā)揮重要作用［38]。本實驗結(jié)果顯示，短時間（24 h）內(nèi)ACP活性濃度降低，通過胞飲作用吸收的蛋白質(zhì)含量減少，吸收的營養(yǎng)物質(zhì)減少，表明銻可以在短期內(nèi)影響斑馬魚對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨后ACP活性又迅速升高，是斑馬魚對銻脅迫適應性的一種表現(xiàn)，可能是因為斑馬魚機體吸收大量營養(yǎng)物質(zhì)來抵抗銻對組織器官的損傷，也有可能是因為銻脅迫導致斑馬魚機體大量細胞受損，細胞內(nèi)存在大量的溶酶體和水解酶進行細胞內(nèi)消化，后期ACP酶活性又降低，表明機體的調(diào)節(jié)機制存在極限。

3.6.2 Sb對AKP活性的影響 AKP主要存在于細胞膜中，參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運和離子分泌等過程，與機體生長、免疫防御和消化吸收功能密切相關(guān)［36-38]。實驗表明，短時間（24 h）高濃度（30、40 mg/L）銻脅迫能促進AKP活性，48 h時不同濃度對AKP活性也呈促進作用，表明其吸收營養(yǎng)物質(zhì)較多，可能是因為斑馬魚為了抵抗銻的毒害作用的一種適應性表現(xiàn)，高濃度下AKP活性降低，可能是機體的調(diào)節(jié)機制存在極限。

4 結(jié)論

隨銻脅迫時間增加，斑馬魚ATP酶、CAT活性呈先降低后增高的現(xiàn)象，SOD、POD、AchE、LDH和ACP活性呈先降低后增高再降低的變化趨勢，AKP酶活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。

銻對斑馬魚的抗氧化酶系統(tǒng)的影響表現(xiàn)為先抑制后促進再抑制，對興奮傳導、能量代謝、物質(zhì)運輸、機體生長和免疫防御等生命過程的中間環(huán)節(jié)產(chǎn)生一定影響。斑馬魚可以通過一系列應激反應緩解銻對其的毒性機制，但其調(diào)節(jié)機制有一定范圍，由于斑馬魚與人類基因的高度相似性，類比銻對人體上述生命過程也可能有明顯的毒害作用。