聚乙烯醇降解細菌篩選及其降解特性

劉亞蘭 段夢潔 林曉珊 張毅

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510000）

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA），是一種人工合成的白色或微黃色片狀、顆粒或粉末狀固體材料。由于其自身存在非常優異的水溶性、乳化性、耐油脂性等性能，所以在造紙業、印染業、食品包裝、安全玻璃生產等行業中均得到了大范圍的應用，而且每年世界上對PVA的需求也在不斷增加，產量快速增長［1]。隨著世界環境保護議題的逐漸加深以及可持續發展理念的實行，有必要篩選出具有高效降解PVA的菌株，并研究其降解機理，使得在不同工業環境下產生的PVA廢水或者PVA固態廢棄物能夠加速降解，以減輕生態環境負荷。

聚乙烯醇是當前世界上為數不多的生物可降解高分子材料，如在真菌和放線菌作用下可以實現對PVA的快速降解，其中以細菌中的假單胞菌和鞘氨醇單胞菌居多，而假單胞菌是當前發現最早的可降解PVA的微生物。1973年，Suzuki等［2]在研究中得到了一株能夠將聚乙烯醇完全降解的菌株PseudomonasO-3，自此聚乙烯醇的可生物降解性越來越受到人們的關注。1983年，Shimao等［3]研究發現了可以降解聚乙烯醇的微生物菌群，主要分為兩大類，第一類由Pseudomonassp.組成，它們自身能夠分泌出大量可降解聚乙烯醇的酶，其發揮降解作用需要吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）作為輔助因子，另外鈣離子和鎂離子在酶的作用過程中也起重要作用；第二類則由Pseudomonassp.和Alcaligenessp.共同組成，Alcaligenessp.主要負責為Pseudomonassp.的生長提供必要的生長因子。1999年，Matsumura等［4]在研究中發現了一株Alcaligenes faecalisKK314，該菌株以聚乙烯醇作為唯一的碳源，它能夠分泌出胞外聚乙烯醇脫氫酶（Polyvinyl alcohol dehydrogenase，PVADH），通過PQQ以及氯化鈣的輔助實現降解功能。Liu等［5]發現Bacillus amyloliquefaciens在有一定量酵母粉的搖瓶優化條件下，可以更加高效地利用聚乙烯醇。當前研究發現，許多微生物對聚乙烯醇材料的獨立降解速率仍然較低，有些對生存環境的要求也相對較高［6]。為了加速環境中廢棄PVA的降解，發掘新的可快速降解聚乙烯醇降解菌株，并研究其相關降解特性、探究其降解機理，是非常有必要的。

影響聚乙烯醇材料生物降解的內部因素包括聚乙烯醇材料本身的聚合度和醇解度。通常認為，聚乙烯醇材料的聚合度越高，材料所需要的降解時間就越長。Corti等［7]學者發現PVA的醇解度相比于聚合度對微生物的降解能力有較大影響，但也有學者用類產堿假單胞菌降解不同型號的PVA時發現，當聚合度一定時，醇解度對PVA降解率的影響并不明顯［8]。

本研究將PVA泡棉材料經過3年的堆肥后，利用Finely法從中篩選出可高效降解PVA的菌株，通過形態學觀察及16S rRNA測序、進化樹分析對其進行了鑒定；使用紅外光譜分析了不同降解期限內PVA泡棉的內部結構特征；利用紫外分光光度計每48 h檢測培養基中PVA的降解率以及菌體OD600，同時對比了4株菌對不同醇解度的PVA的降解速率的影響，旨為PVA降解菌株的應用以及聚乙烯醇生物降解機制研究提供一定的參考理論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料及樣品 聚乙烯醇：PVA1788，聚合度 1 700，醇解度88%，灰分含量低于0.7%；PVA1799，聚合度 1 700，醇解度99%，灰分含量低于0.7%，兩者均購自臺灣長春化工有限公司；聚乙烯醇泡棉：長15.0 cm、寬10.0 cm、厚度2.0 cm，由PVA1799制成，重量約50.0 g，含水量70%，由臺灣東海大學張有義教授提供。

1.1.2 培養基 LB培養基g/L：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，pH 7.0±0.2。

LB瓊脂培養基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母膏粉5.0，NaCl 5.0，葡萄糖1.0，瓊脂15，pH 7.0±0.2。

篩選培養基（g/L）：PVA1799 0.5，NH4NO30.1，K2HPO41.6，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，瓊脂 15.0，pH 7.0-7.2。

基礎培養基1：PVA1788 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同篩選培養基。

基礎培養基2：PVA1799 3.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，其余同篩選培養基。

1.1.3 主要試劑及儀器 顯色劑：A：4.0 g/L硼酸溶液；B：KI-I2溶液儲備液：KI 2.5 g/L，I21.27 g/L。革蘭氏染色液，廣東環凱微生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302），天根生化科技（北京）有限公司；PCR 擴增相關試劑，TaKaRa 公司；PCR 儀（Mastercycler X50），德國 Eppendorf 公司；紫外分光光度計 UV-2000，美國尤尼柯公司；恒溫培養搖床 THZ-300，上海一恒科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機FD-1B-50，上海仙象儀器儀表有限公司；傅里葉紅外光譜儀Nicolet 6700，賽默飛世爾科技分子光譜部；ZEISS掃描電鏡，德國卡爾蔡司股份公司。

1.1.4 堆肥來源 本研究中的堆肥從君得生物科技有限公司購買，主要組成為：雞糞52.02%（W/W），稻草28.45%（W/W），含水率 68%（W/W），pH 6.73。

1.2 方法

1.2.1 PVA泡棉的堆肥實驗 將聚乙烯醇泡棉剪裁成3.5 cm× 2.0 cm× 1.0 cm的小長方塊樣品若干，置于裝有一定量堆肥的收納箱中，使其均勻分布，總深度大約10.0 cm，隨后將收納箱放在室溫條件下避光存儲［9]。整個堆肥過程每2 d在其表面噴灑適量無菌水，以保證堆肥的濕度。

1.2.2 PVA降解菌株的篩選分離 取經堆肥作用3年的PVA泡棉樣品若干，去掉樣品表面的殘存堆肥，稱量3 g已降解幾近為粉末狀的聚乙烯醇泡棉，置于裝有無菌生理鹽水的錐形瓶中，在37℃、150 r/min條件下震蕩30 min，使材料表面的微生物充分洗脫下來，從中取50 μL 液體接種于篩選培養基平板上，均勻涂布后置于37℃生化箱恒溫培養，待到平板菌落不再增多時（6 d），挑取平板上的菌落，利用LB培養基進行富集。由于定型濾紙片可以使菌體更好地附著在平板上，且有利于直觀查看透明圈效果，故使用直徑約1.5 cm的滅菌濾紙片將LB培養液內的菌體接種在篩選培養基平板上，連續培養6 d，然后對其開展Finley透明圈實驗，通過觀察透明圈大小判定微生物對聚乙烯醇的降解能力［10]。對于產生較大透明圈的菌株，進行純化分離及菌株保藏（與甘油混合后，置于-80℃凍存），并進行形態學觀察。

1.2.3 Finley透明圈實驗 將顯色劑A與顯色劑B進行4∶1混合［11]，從中取出3 mL滴加在平板上，輕輕晃動使其均勻覆蓋整個平板，避光處理10 min［12]后觀察顯色結果。

1.2.4 聚乙烯醇降解菌株的鑒定

1.2.4.1 菌落形態及細胞形態觀察 在LB瓊脂培養基上將4株菌培養12 h后，觀察并記錄菌落形態，同時用無菌接種環在平板上挑取適量菌體進行革蘭氏染色。另外取經LB液體培養基培養12 h的適量菌液，經戊二醛固定、乙醇梯度脫水和臨界點干燥后，進行電鏡掃描。

1.2.4.2 細菌DNA的提取 取在LB培養基中37℃恒溫培養24 h的菌體培養液10 mL，在6 000 r/min、4℃條件下離心5 min，取沉淀部分，按照細菌提取試劑盒操作說明進行DNA提取。

1.2.4.3 PCR擴增 從細菌16S rDNA片段中選擇V1-V9區，以通用擴增引物實現對樣品DNA的擴增 處 理［13]， 以 F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）作為上游引物，R1429（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為下游引物。具體操作為：將樣品在94℃條件下預變性2 min；然后在94℃下繼續處理30 s；將溫度調為50℃處理30 s；升溫至72℃處理2 min，按照這個操作循環處理30次；最后在72℃條件下延伸10 min。上述處理完成之后，從上述樣品中取出5 μL擴增產物與1 μL 6×Loading Buffer進行混合，上樣置于1% 的瓊脂糖凝膠中，在電壓120 V下電泳處理30 min。電泳結束后，將凝膠放在3×Gelred核酸染料中染色10 min，最后將凝膠置于凝膠成像系統來對PCR擴增效果進行驗證。

上機測序：PCR樣品經過純化之后，樣品測序由廣州艾基生物技術有限公司進行。

數據分析：根據得到的DNA序列，通過Blast進行比對，然后下載相似菌株及相鄰物種的DNA序列，通過Clustal W對比其序列，以MEGA 7.0.26來建立系統發育樹［14]。

1.2.5 PVA標準曲線測定 標準溶液制備［15]：取PVA為5.0 g/L 的基礎培養基，通過不含PVA的培養基將其進行稀釋，得到含PVA為0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 g/L的培養基，將這6個不同濃度PVA的培養基作為標準溶液。OD值測定：將上述標液與顯色劑B、A按照2∶2∶6的比例進行反應［11]，同時將不含PVA的基礎培養基與KI-I2、硼酸溶液進行反應作為空白，避光處理15 min，在其最大吸收峰波長處［PVA1788（495 nm）；PVA1799（500 nm）]測定上述反應液對應的OD值，每組試驗平行測試3次，然后根據得到的數據，以PVA濃度作為橫坐標，OD值為縱坐標，得到本次試驗的標準曲線［12]。

1.2.6 分離菌株對PVA1788/99的降解 取各菌株在LB培養基中培養12 h的發酵液，按1% 接種量接種于基礎培養基1和2中，每48 h對培養基中PVA濃度、活菌濃度進行測定。搖瓶培養條件均為37℃、150 r/min；活菌濃度在OD600條件下測定；本文中所有實驗均設置3個平行，并取其平均值。

發酵液離心：6 000 r/min條件下對各發酵液離心5 min，獲取上清液。

OD值測定：利用1.2.5中OD值的測定方法來測定每個樣品與顯色劑反應后的OD值，并經標準曲線方程計算得PVA濃度，經公式1-1計算得PVA的降解率。

其中，C0代表培養基中最初的PVA濃度；Ct代表時間t時刻下培養基中PVA的濃度。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析 將堆肥0個月（初始PVA泡棉）、3個月、2年、3年的PVA泡棉取出，用無菌水清洗3次，經真空冷凍干燥機處理12 h。取適量冷凍干燥后的樣品研磨至均勻粉末狀，沾取適量溴化鉀［16]后利用傅里葉紅外光譜儀進行測試。測試范圍為400-4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

2 結果

2.1 PVA降解菌株的分離鑒定

2.1.1 透明圈產生結果 圖1顯示的是各菌株在篩選培養基中形成的透明圈，相同培養條件下，形成的透明圈尺寸較大且界面清晰，可初步說明該菌株具有較好的PVA降解能力。

2.1.2 菌落及細胞形態觀察 在LB瓊脂培養基上將4株菌培養12 h后，DG01的菌落直徑大小約為8.9 mm，DG02的菌落直徑大小約為12.2 mm，且兩者的菌落形態結構相似，即菌落中心較濕潤，邊緣較整齊且干燥，菌落呈米黃色，表面有明顯的細絲狀痕跡；DG03和DG04的菌落直徑約為1 mm，菌落邊緣整齊，半透明，有明顯的光澤，乳白色。

圖1 各篩選菌株產生的透明圈

根據革蘭氏染色結果，DG01、DG02均屬于革蘭氏陽性桿菌，DG03、DG04為革蘭氏陰性桿菌。由掃描電鏡圖（圖2）可看出，DG01與DG02菌體為橢圓棒狀，大小分別約為1.36 μm×2.50 μm和1.40 μm×3.20 μm；DG03和DG04菌體為長桿狀，大小分別約為 0.83 μm×2.70 μm 和 0.90 μm×2.85 μm。

2.1.3 微 生 物16S rRNA鑒 定 結 果 在DG01、DG02、DG03和DG04菌株中，其16S rDNA片段長度依次為1 384、1 355、1 340和1 381 bp，非常接近一般的16S rDNA長度（1 540 bp），這也充分說明了測序結果的真實性。進一步經過Blast序列比對可知，DG01、DG02、DG03和DG04依次與Bacillus thuringiensisBM-BT15426、Bacillus thuringiensisBMBT15426、Paenibacillus pabuliSW12、Paenibacillus pabuliSW12的同源性達到100%。以Clustal W來比對下載的相似菌株及相鄰物種DNA序列，并通過MEGA 7.0.26來建造系統發育樹，結果如圖3所示。可初步確定DG01、DG02菌株為Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525），DG03、DG04菌 株 為Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。

2.2 PVA泡棉的紅外表征

本實驗使用紅外技術對經過不同堆肥時期的PVA泡棉進行分子結構檢測，結果如圖4所示。由圖可知，堆肥3個月與初始PVA泡棉在特征區及指紋區產生峰的位點大致相同，因此可知聚乙烯醇泡棉的分子結構沒有發生明顯的變化。通過分析堆肥2年的PVA泡棉紅外圖譜可知，圖譜中沒有了甲基基團，而在2 780.94 cm-1處存在一較強的峰，在1 720.54 cm-1，1 411.15 cm-1，1 241.56 cm-1處 也 有較強的吸收峰，說明其中存在羧基；另外，指紋區在691.30 cm-1處出現了較強峰，表明堆肥在降解的過程中形成了新的羥基。觀察降解3年材料的紅外光譜可發現，在2 780.74 cm-1處有一強烈峰，對應指紋區在1 719.43 cm-1，1 419.30 cm-1，1 236.27 cm-1處存在較強峰，表明系統中存在羧基；同時在690.26 cm-1處存在較強峰，說明也產生了新的羥基。

圖2 各篩選菌株的掃描電鏡結果

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹

2.3 分離菌株對PVA1788/99的降解

2.3.1 標準曲線的繪制 采用1.9中PVA標準曲線測定方法后，得到PVA1788溶液的標準曲線為：Y1=0.15X1+0.018，R2=99.79%， 方 程 中X1代表 PVA1788濃 度，Y1為 OD值，PVA1788濃 度與λ=495 nm處各標準反應液OD值呈良好的線性關系；得到PVA1799溶液標準曲線方程為：Y2=0.22X2+0.018，R2=99.65%，PVA1799濃 度 與λ=500 nm處各標準反應液OD值呈良好的線性關系。

2.3.2 PVA1788/99的降解與菌體生長關系 圖5顯示的是四株細菌對PVA1788/99的降解率及菌體濃度變化曲線。在8 d的降解過程中，DG01、DG02、DG03和DG04對PVA1799的降解率依次為58.27%、54.47%、43.32%和46.59%，對PVA1788的降解率分別達到67.27%、74.99%、56.74%和59.7%。四株菌對PVA1788降解率明顯高于對PVA1799的降解率，說明低醇解度的PVA更有利于微生物的降解。從圖5-B、5-D可以看出，在0-2 d，PVA1799基礎培養基內活菌濃度增長最快，對應的PVA1799的降解速率也達到最快，說明各菌株對PVA1799的降解能力主要受到菌體增殖速率的影響；從圖5-A、5-C可以看出，在0-2 d，DG01、DG02和DG04處于對數增長期，對應的PVA1788降解速率最快，DG03菌體的對數增長區間是在0-4 d，其對應的PVA1788降解速率上升區間也是在0-4 d，說明了PVA1788消耗和菌體的個體生長也呈相關關系。另外，圖5-B、5-D顯示，在2-8 d時，當PVA1799基礎培養基中的活菌濃度有所下降直至穩定狀態時，PVA1799的降解速率也開始下降并逐漸趨于穩定；從圖5-A、5-C可看出，在2-8 d時，DG01、DG02和DG04的菌體濃度趨于穩定，PVA1788的降解速率曲線也趨于平緩，而DG03的菌體濃度穩定時期和PVA1788的降解速率趨穩時期則是4-8 d。以上結果表明，對于PVA1788/99的降解，4株菌的菌體生長與PVA1788/99的降解率變化趨勢密切相關；除DG03對PVA1788的降解率增長區間在0-4 d外，其余3株菌對PVA的降解率最快時期和自身增長對數期都在0-2 d。此外，從菌種屬來看，屬于Bacillussp.的DG01和DG02對PVA1788/99的降解率要普遍高于屬于Paenibacillussp.的DG03和DG04。

圖4 不同堆肥期中PVA泡棉材料的紅外吸收比對圖

3 討論

目前發現的能夠降解PVA材料的菌株主要分布于Pseudomonas，而屬于Bacillus及Paenibacillus的只有少數，根據學者 Chio等［17]的研究可知，通過將Microbacterium barkeriKCCM10507與Paenibacillus amylolyticusKCCM10508兩種菌株按照一定的比例進行混合，能夠實現對污水中聚乙烯醇的快速降解。另外，Mori等［18]在1996年從污泥中分離到一株Bacillus megaterium，其必須在與PN19共同培養的情況下才能降解聚乙烯醇。本研究通過3年的實驗室條件堆肥之后，利用以PVA1799為唯一碳源的基礎培養基，從已降解的PVA泡棉材料中篩選出了可獨立降解PVA的高效菌株，該菌株在8 d內對3 g/L PVA的降解率最高可達74.99%，且不需要添加PQQ、金屬離子等促生長因子，可獨立進行PVA代謝，具有一定的開發價值和應用前景。

紅外光譜圖可用于研究分子的結構和化學鍵，由物質分析得到的紅外譜圖可反映出物質所含的官能團種類，結合特征譜和指紋區的分析即用來表征和鑒別化合物。經過3年的堆肥后，PVA泡棉已由原來的塊狀變為幾近粉末狀，另有少量碎塊。在實驗所得的紅外圖譜中發現，相比堆肥3個月的PVA泡棉與原始PVA泡棉材料，兩者在特征區及指紋區產生峰的位點比較相似，這就意味著堆肥前后材料的分子結構不會出現明顯的改變，繼而說明短時間的堆肥對PVA泡棉的影響作用不大，可對其產生降解作用的微生物可能還未富集到能對PVA泡棉產生明顯降解作用的程度。而經過2年和3年堆肥期的PVA泡棉材料的紅外圖譜顯示，甲基基團消失，同時伴隨著新的羧基和羥基的產生，Chen等［19]學者在研究混菌對PVA1799的降解作用時，也發現了降解后的PVA1799出現了新的羥基等基團。新的官能團的出現，說明PVA泡棉分子結構的改變，繼而說明微生物菌體對其產生了降解作用。

在PVA1788/99的降解研究過程中，所使用的基礎培養基僅以PVA作為碳源，未添加其他的碳源物質，因此4株菌只能夠利用PVA為碳源來滿足自身生長及代謝需求。由PVA降解速率與菌體濃度變化曲線圖分析可知，PVA材料的降解與菌體的生長、增殖過程存在著緊密的聯系。在菌體的對數生長期，培養基中的PVA濃度較高，營養物質較為豐富，此時菌體生長較快，對PVA的代謝也比較旺盛，降解速率最快；而在菌體生長平臺期，菌體的增長率降低，PVA的代謝速率隨之減慢。從圖5可看出，PVA1788/99的降解率在菌體生長的對數期時已達成近2/3，剩下的1/3則是在菌體生長平臺期達成，可見菌體生長平臺期時PVA降解效率明顯低于生長對數期。此外，當PVA的聚合度同為1 700時，篩選出的4株細菌對PVA1788和PVA1799的降解效果顯著不同，說明醇解度在一定程度上影響到PVA的降解效果。在研究中得到的菌株Bacillussp.DG01、Bacillussp.DG02、Paenibacillussp.DG03、Paenibacillussp.DG04對PVA1788的降解速率整體上比PVA1799快，說明在聚合度一定時，較低醇解度的PVA更易被微生物分解利用。

圖5 篩選菌株及菌株濃度變化及菌株對PVA1788/99降解率的影響

大多數學者認可的PVA降解機制為［20]：PVA長鏈上兩個相鄰羥基發生脫氫反應生成氧化型PVA，接著氧化型PVA的長鏈結構再被水解為短鏈，短鏈再發生脫氫，再經水解為更短的短鏈，不斷循環，最終生成CO2和H2O，在此降解過程中，可產生乙酸和甲基酮類物質［21-22]。結合菌體生長曲線及PVA的降解率情況及紅外圖譜，作者推測，菌體在對數生長期時通過自身分泌的酶將PVA長鏈切割為短鏈進而利用，但隨著短鏈的不斷循環切割，原來以1，3-二醇鍵形式連接在主鏈上的羥基可能以新的鍵型出現，并在碳原子上連接了新的羧基或者其他基團，而菌體對新的羥基和羧基等基團的適應性不夠，或者自身分泌的酶無法對這些新的基團再進行作用，所以菌體的生長受到限制。要使菌體生長代謝進一步提高，可嘗試對菌體進行長期馴化使其能夠利用不同類型的PVA的切割短鏈。

4 結論

本研究經堆肥實驗，篩選出了4株具有獨立降解PVA1788/99效果的細菌，即Bacillussp.DG01（Accession No.MK208524）、Bacillussp. DG02（Accession No.MK208525）、Paenibacillussp. DG03（Accession No.MK208526）、Paenibacillussp. DG04（Accession No.MK208527）。4株細菌對低醇解度的PVA1788的降解率要高于PVA1799，菌體的生長代謝與PVA降解率的變化密切相關。經過2年、3年堆肥，PVA泡棉原來的甲基消失，產生了新的羥基和羧基。

致謝：

本實驗中所用的聚乙烯醇泡棉材料由中國臺灣東海大學張有義教授提供，在此表示衷心的感謝。