大腸桿菌乙醇工程菌mglB基因的敲除對混合糖發酵木糖利用效率的影響

許瓊丹 王永澤 王金華 趙筱

（湖北工業大學生物工程與食品學院 武漢 430068）

木質纖維素材料降解產生的糖類可用于微生物發酵，但葡萄糖會對木質纖維素材料中其他糖類的利用產生影響。木質纖維素中約有四成左右的糖類如木糖和阿拉伯糖因為葡萄糖的存在而無法得到徹底的利用［1]。這主要是因為分解代謝產物阻遏效應（Carbon catabolite repression，CCR），即葡萄糖的存在會抑制阻遏其他糖類（如木糖）的代謝，使得大腸桿菌只有優先利用完葡萄糖后，才能再利用其他糖類［2-3]。該阻遏效應與磷酸烯醇式丙酮酸-糖類磷酸轉移酶系統（Phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS）密切相關。PTS系統負責特異性地將葡萄糖從細胞外跨膜主動運輸進入細胞，同時將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，進入糖酵解途徑［4]。在此轉運過程中，可溶性蛋白EIIAGlc（由crr基因編碼）和結合在質膜上的特異性轉運蛋白EIIBGlc（由ptsG基因編碼）的去磷酸化狀態的積累，與分解代謝產物阻遏直接相關［5-6]。遺傳分析也得到相同結論，突變crr基因和ptsG基因，可弱化分解代謝產物阻遏［7-8]。國內外已有許多通過改變PTS系統相關基因表達量的方法來降低分解代謝產物阻遏效應，從而提高木糖利用效率，增強發酵強度，提高發酵產量的研究報道。Nichols等敲除ptsG基因的乙醇工程菌可利用混合糖發酵，產率達理論值的 87%-94%［9]。Liang等［10]通過敲除pflB，ldhA，ppc和ptsG基因構建的工程菌混合糖發酵產琥珀酸，產量達到83 g/L。丁小云等［11]敲除ptsG基因的乳酸工程菌可同時利用葡萄糖和木糖發酵產D-乳酸，產量為83.04 g/L。Yao等［12]發現增強crp基因能夠使大腸桿菌同時消耗葡萄糖和木糖，而敲除ptsG，或mgsA，或pgi基因都可以導致crp基因轉錄水平的增加。可以看到，目前對于混合糖利用都側重于降低分解代謝產物阻遏效應以提高木糖的利用。

葡萄糖的入胞除了依賴PTS系統進行跨膜轉運之外，也可依賴于半乳糖轉運系統等非PTS系統來完成。目前已知半乳糖轉運系統有兩種運輸載體半乳糖轉運蛋白（GalP）和MglBAC復合蛋白（MglA：ATP結合蛋白；MglB：糖結合蛋白；MglC：跨膜運輸蛋白），可對葡萄糖進行轉運［11-12]。GalP是一種H+共轉移載體，在將葡萄糖轉運至胞內的同時需要轉運H+。MglBAC復合蛋白屬于轉運蛋白中的ABC（ATP-binding cassette）家族，轉運過程中需要額外消耗ATP［13-14]。不同于PTS系統的邊轉運邊磷酸化，這兩種運輸載體在轉運葡萄糖時不改變其構象，之后由葡萄糖激酶（Glk）催化生產葡萄糖-6-磷酸進入糖酵解途徑。這些同屬于葡萄糖轉運系統的基因對木糖的利用是否有影響，目前還鮮有報道。

在前期的工作中，我們以產纖維乙醇的大腸桿菌工程菌SZ470為出發菌，在此基礎上構建了ptsG缺陷菌株SZ470P，通過降低分解代謝產物阻遏效應增加混合糖發酵時木糖的利用效率［15]。本文中，我們擬敲除非PTS轉運系統且也能轉運葡萄糖的基因，即半乳糖轉運系統中的mglB基因，得到mglB缺失菌SZ470M和ptsG/mglB雙缺陷株SZ470PM。通過發酵驗證和轉錄水平分析，明晰葡萄糖非PTS轉運系統相關基因對木糖利用效率的影響，探討 PTS和非PTS轉運系統是否對木糖利用存在協同影響，從而為木質纖維素木糖充分利用提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 出發菌株分別為大腸桿菌乙醇工程菌SZ470和SZ470P。SZ470是能夠利用五碳糖發酵高產乙醇的工程菌，其來源于野生菌株Escherichia.coli B，并敲除了乙酸激酶（ackA），延胡索酸還原酶（frdABCD），丙酮酸甲酸裂解酶（focA-pflB），D-乳酸脫氫酶（ldhA）等基因，并通過無氧啟動子融合表達技術倍增了NADH還原力［16-18]；SZ470P則是在SZ470的基礎上敲除了參與葡萄糖磷酸轉移酶系統中的編碼基因ptsG［15]。質粒pKD4（包含FRT-kan-FRT閱讀框），同源重組質粒pKD46（溫度敏感型復制子，Ampr）。出發菌株與質粒均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA Marker，PCR Master Mix購自Fermentas公司，細菌基因組DNA抽提試劑盒購于天根生物有限公司。氨芐青霉素和卡那霉素購自Mersco公司，PCR引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。分析純葡萄糖、蔗糖及其他無機鹽等購于國藥集團。

Sartorius BB-8846880發酵罐（德國Sartorius Stedim Biotech公司），Waters e 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），GC-2014/SHIMAD20氣相色譜儀（美國GC公司），mycycler PCR儀（美國Bio-Rad公司），MicroPluser電轉儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L；種子培養基：LB 培養基；發酵培養基：LB 培養基加混合糖（3%葡萄糖和2%木糖）或單糖（5%木糖）；選擇培養基：LB 固體培養基加抗生素（50 mg/L 氨芐青霉素或卡那霉素）。

1.2 方法

1.2.1mglB基因的敲除 PCR引物設計如表1所示。

表1 mglB的敲除引物與鑒定引物

根據mglB序列設計敲除引物P1和P2，如表1所示，該對引物5'端45 bp片段與mglB基因序列同源，另外18-20 bp（表中下劃線序列）與質粒pKD4上FRT-kan-FRT閱讀框序列同源，以pKD4為模板進行PCR擴增可得到帶有卡那霉素抗性基因的PCR片段。擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個循環 ；72℃ 5 min。用 CaCl2法將pKD46轉化入SZ470和SZ470P的細胞中，通過氨芐平板篩選得到陽性菌落。將陽性菌落的細胞在添加2%的L-阿拉伯糖的LB培養基中，30℃條件下進行液體培養至OD600= 0.6。經過無菌去離子水清洗后，得到SZ470/pKD46，SZ470P/pKD46的感受態細胞。再用電轉的方法將擴增的PCR片段分別轉化到這兩種感受態細胞中。30℃復蘇培養2 h，涂布于含卡那霉素的LB 培養基選擇平板。37℃培養24 h，挑選生長良好的陽性單克隆在卡那霉素抗性平板上轉接1-2次，并用鑒定引物P3、P4進行PCR 驗證。將成功敲除mglB基因的SZ470和SZ470P 菌株分別命名為SZ470M和SZ470PM。

1.2.2 發酵罐發酵培養 挑4-6個在LB平板上生長了24 h的單菌落，接入200 mL種子培養基，200 rpm，37℃培養至OD600為0.8-1.2左右。以10%的接種量將細胞接種至3 L發酵培養基，置于帶有自動調節系統7 L發酵罐，200 rpm，37℃培養發酵。定時取樣，測定菌體濃度OD600，糖濃度，乙醇及其他代謝產物的濃度等。

1.2.3 發酵產物檢測分析 菌體濃度測定在可見光分光光度計測定波長600 nm 下OD 值。葡萄糖、木糖采用高效液相色譜法分析，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，流動相為4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測器為PDA、ELS 檢測器。乙醇采用氣相色譜儀進行測定，測定條件：采用氫離子火焰檢測器（FID），毛細管柱，柱溫40℃，進樣溫度200℃，檢測器溫度200℃，載氣為氮氣，流速2 mL/min，正丙醇作為內標，進樣0.5 μL。乙醇理論產量計算：1 mol 葡萄糖產生2 mol 乙醇，1 mol 木糖產生1 mol 乙醇。乙醇轉化率為實際產量與理論產量之比。

1.2.4 基因轉錄水平差異分析 收集混合糖發酵24 h的細胞，根據的方法提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行反轉錄，并用QTaqTMOne-Step qRT-PCR S對 YBR? KIT進行目標基因的定量分析。引物序列見表2。以cysG作為內參基因［19]，以SZ470中目標基因的轉錄水平為對照，計算SZ470M，SZ470P和SZ470PM中各目標基因轉錄水平的差異倍數。對基因轉錄水平進行顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 mglB基因缺陷菌株SZ470M和SZ470PM的鑒定

分別以SZ470和SZ470P為對照，以鑒定引物P3和P4對菌株SZ470M和SZ470PM進行PCR驗證，其結果如圖1所示。根據RED同源重組技術的原理，擴增的卡那霉素抗性基因PCR片段具有與mglB基因同源的45 bp序列，該片段通過同源重組整合到菌株基因組上從而將目的基因敲除。因此，SZ470M和SZ470PM經鑒定引物PCR擴增后其產物大小為1550 bp，與卡那霉素抗性基因PCR片段大小一致。而對照菌株SZ470和SZ470P的鑒定引物擴增產物則為mglB基因，片段大小為999 bp。圖1中結果符合預期，說明mglB基因敲除成功。

2.2 混合糖發酵

2.2.1 菌體生長曲線 在以水稻秸稈為代表的木質纖維素水解液中，由纖維素以及半纖維素降解得到的葡萄糖約占60%，而由半纖維素降解得到的木糖以及少量阿拉伯糖等糖類占其他40%［20]。因此，本研究中設定3%葡萄糖+2%木糖的混合糖發酵條件，對比SZ470，SZ247M，SZ470P，SZ470PM的菌體生長情況，結果如圖2所示。SZ470發酵24 h時，OD達到最大9.2從而進入穩定期；SZ470M和SZ470P在30 h時OD值分別達到9.8和10.6，SZ470PM則在42 h OD值為11.8。雖然SZ470最先進入穩定期，但其最大OD值為4株菌中最小，而SZ470M，SZ470P和SZ470PM的最大OD值分別為SZ470最大OD值的1.06，1.15和1.28倍。在發酵的前42 h內，相對SZ470而言，SZ470M的菌體生長量與其相差不大；而SZ470P和SZ470PM的菌體增長則更為明顯，說明后兩者可以攝取更多的碳源，用于菌體生長。

表2 qPCR擴增引物

圖1 mglB基因敲除驗證

圖2 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發菌株SZ470混合糖發酵（3%葡萄糖+2%木糖）的菌體生長情況

2.2.2 葡萄糖與木糖消耗曲線 四株菌的葡萄糖的消耗情況如圖3和表3所示。四株菌在24-48 h內可發酵完葡萄糖。由于mglB基因的敲除，SZ470M和SZ470PM相對于各自的出發菌株而言，葡萄糖消耗速度都有所降低。說明mglB基因可以通過阻斷葡萄糖通過MglBAC復合蛋白運輸途徑來降低葡萄糖入胞速度。而SZ470PM葡萄糖糖耗速度的進一步降低，說明葡萄糖轉運系統的阻斷對于葡萄糖轉運速度的下降有疊加效應。對比SZ470PM和SZ470可知，mglB和ptsG的敲除使葡萄糖的消耗速度下降43%，消耗時長則增加近一倍。

四株菌的木糖消耗情況與如圖4和表3所示。SZ470和SZ470M的發酵周期最長，并且在前24-30 h時間內，即葡萄糖消耗完畢之前，木糖基本沒有消耗，整個發酵周期木糖消耗速度沒有明顯變化。該結果說明單獨敲除mglB基因，并不能降低分解代謝產物阻遏效應，對木糖的利用效率也沒有明顯影響。而SZ470P和SZ470PM木糖消耗與葡萄糖消耗可同時進行，說明分解代謝產物阻遏效應在這兩株菌中程度有所降低。如表3所示，SZ470P和SZ470PM的木糖消耗速度分別為0.28 g/（L·h）和0.37 g/（L·h），相對于SZ470的木糖消耗速度分別提高了33%和76%。該結果說明ptsG基因的缺失，可以有效降低分解代謝產物阻遏效應，使得木糖與葡萄糖同時利用。而雙缺陷菌SZ470PM的木糖消耗速度比ptsG缺陷菌SZ470P提高32%，說明在降低分解代謝產物阻遏效應的基礎上，mglB基因的敲除也可提高木糖利用效率。

圖3 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發菌株SZ470混合糖發酵（3%葡萄糖+2%木糖）的葡萄糖消耗曲線

表3 SZ470，SZ470M，SZ470P和SZ470PM混合糖發酵的比較

圖4 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發菌株SZ470混合糖發酵（3%葡萄糖+2%木糖）的木糖消耗曲線

2.2.3 乙醇產量 四株菌的乙醇產量如圖5和表3所示，在發酵的前24 h，SZ470的乙醇產量高于其他3株菌。發酵30 h之后，SZ470PM和SZ470P的乙醇產量超過SZ470。SZ470和SZ470M發酵90 h，乙醇產量分別是18.98 g/L和19.25 g/L。SZ470P 的乙醇產量為21.16 g/L，相較于SZ470，產量提高了2.18 g/L，轉化率提高9.3%。SZ470PM的乙醇產量為23.25 g/L，相較于SZ470，產量提高了4.27 g/L，轉化率提高15.1%；相較于SZ470P，產量提高了2.09 g/L，轉化率提高了5.8%。

圖5 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發菌株SZ470混合糖發酵（3%葡萄糖+2%木糖）的乙醇產量

2.2.4 木糖代謝關鍵基因轉錄水平分析 從發酵實驗結果來看，ptsG基因的敲除和ptsG/mglB基因的雙敲除，都可提高混合糖發酵時木糖的消耗速度，乙醇生產強度及產量。為了進一步探討葡萄糖轉運基因的缺失對混合糖發酵時木糖利用效率的影響，將混合糖發酵24 h的細胞提取RNA，反轉錄后通過Real-time qPCR對木糖轉運及代謝的相關基因進行轉錄水平分析，結果如圖6所示。以SZ470為對照，SZ470M只有xylG基因有明顯差異，其他目標基因差異不顯著，說明木糖代謝相關途徑沒有明顯改變，這與SZ470M在混合糖發酵時其發酵能力與SZ470相差不大的結果相符。而SZ470P和SZ470PM中xylA，xylB，xylE，xylF和xylH的基因轉錄水平有顯著性提高，且后者程度更強。說明ptsG基因的敲除和ptsG/mglB基因的雙敲除，可提高木糖轉運和代謝途徑關鍵基因的轉錄水平，從而提高混合糖發酵時木糖代謝效率，進而提高乙醇產量和生產強度。

圖6 混合糖發酵（3%葡萄糖+2%木糖）時木糖轉運及代謝基因轉錄水平的變化（發酵24 h）

2.3 SZ470與SZ470PM木糖發酵

SZ470PM與SZ470混合糖發酵結果對比說明ptsG/mglB基因的雙敲除對木糖的利用效率有明顯提高。為探討木糖作為單一碳源發酵時這兩個基因對木糖利用效率的影響，以5%木糖為碳源對SZ470PM和SZ470進行發酵，其糖耗曲線和乙醇產量如圖7所示。結果表明，SZ470和SZ470PM在96 h內將木糖完全消耗，最終乙醇產量分別為21.56 g/L和21.87 g/L，且兩者的木糖消耗速度和乙醇生產強度沒有明顯差別。而從兩株菌的菌體生長情況來看，也無明顯差別（如圖8）。

圖7 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470PM與出發菌株SZ470木糖（5%）發酵的糖消耗曲線和乙醇產量

圖8 大腸桿菌葡萄糖轉運基因缺陷菌SZ470PM與出發菌株SZ470木糖（5%）發酵的菌體生長情況

3 討論

綜合四株菌的混合糖發酵情況來看，mglB基因和ptsG基因的敲除都可以降低葡萄糖的消耗速度，原因是分別阻斷葡萄糖通過MglBAC和PTS兩種轉運途徑的運輸，造成葡萄糖入胞通量減少。從菌體生長情況來看，SZ470P和SZ470PM的菌體增長則更為明顯，說明后兩者可以攝取更多的碳源，用于菌體生長。而SZ470PM的菌體生長量高于SZ470P，原因可能為通過阻斷能量消耗較高的MglBAC運輸途徑，使得葡萄糖入胞的能量消耗降低，使更多的能量用于菌體生長，從而導致發酵乙醇總產量增加。從木糖利用效率來看，單獨敲除mglB基因并不能提高木糖消耗速度。只有敲除ptsG基因才可通過降低分解代謝產物阻遏效應，達到葡萄糖與木糖同時利用從而提高木糖消耗速度，說明葡萄糖非PTS轉運系統不能單獨對木糖利用效率產生影響。而ptsG/mglB雙缺陷菌SZ470PM木糖消耗速度高于SZ470P，說明在敲除ptsG基因降低分解代謝產物阻遏效應的基礎上，mglB基因的敲除對木糖利用效率的提高具有協同效果。因此，SZ470PM在四株菌中木糖消耗速度相對于SZ470，SZ470M，SZ470P分別提高了76%，76%和32%。綜合來看，SZ470PM體現出在混合糖發酵條件下木糖利用效率高，發酵周期短，乙醇產量和轉化率高的優點。

從混合糖發酵條件下木糖轉運與代謝關鍵基因的轉錄水平的分析上看，也可得到相同結論。木糖通過H+共運輸載體XylE和專一性運輸載體XylFGH轉運入胞，編碼這兩種載體的基因xylE和xylFGH受蛋白XylR的調控［21]。木糖入胞后由XylA催化形成木酮糖，再由XylB催化形成木酮糖-5-磷酸。以SZ470為對照，SZ470P和SZ470PM與木糖轉運與代謝相關基因的轉錄水平都有顯著上調，且SZ470PM的上調程度要高于SZ470P。說明通過敲除ptsG基因，可以通過阻斷與分解代謝產物阻遏效應相偶聯的PTS轉運系統來降低對木糖代謝途徑的抑制，從而提高木糖轉運和代謝相關基因的轉錄水平；而進一步敲除mglB基因，則對木糖木糖轉運和代謝相關基因的轉錄水平的上調有協同影響。和SZ470P相比，SZ470PM木糖H+共運輸載體的編碼基因xylE的上調趨勢要比專一性運輸載體XylFGH的編碼基因xylF，xylG，xylH的上調趨勢更加明顯，原因是專一性運輸載體XylFGH比木糖H+共運輸載體XylE更耗能［22-23]，所以從能量的角度來考慮木糖入胞更趨向于通過木糖H+共運輸載體XylE來轉運。因此，xylE基因的轉錄水平上調更為顯著。

但由菌株SZ470PM與SZ470在木糖單糖發酵情況比對來看，ptsG與mglB雙基因的敲除，并沒有對木糖利用效率造成顯著影響。其原因可能在于，以木糖為單一碳源時，葡萄糖轉運代謝相關基因無需大量編碼相關蛋白，細胞也不需要消耗能量用于葡萄糖分子的主動轉運及代謝。因此，SZ470PM與SZ470的菌體生長，木糖消耗速度以及乙醇產量無明顯差異。說明，葡萄糖PTS和非PTS轉運系統相關基因只有在混合糖條件下對木糖利用才存在協同效應。

綜上，葡萄糖轉運基因ptsG和mglB基因的敲除，可降低混合糖發酵時分解代謝產物阻遏效應和葡萄糖入胞速率，提高木糖轉運和代謝相關基因的轉錄水平，從而提高木糖消耗速度及利用效率。

4 結論

本研究通過對大腸桿菌葡萄糖轉運基因mglB的敲除，構建的ptsG/mglB雙缺陷乙醇工程菌SZ470PM，在混合糖發酵時，具有木糖利用效率高，發酵周期短，乙醇轉化率高的特點，是具有可利用木質纖維素發酵產乙醇的潛力。通過比較混合糖發酵性能和木糖轉運與代謝相關基因的轉錄水平分析，得出葡萄糖PTS和非PTS轉運系統相關基因對木糖利用存在協同影響，為木質纖維素木糖的高效利用提供一定理論依據。